Microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione per una caratterizzazione strutturale dell'amiloide label-free

Negli ultimi decenni, sebbene vi sia stato uno sviluppo significativo di numerose tecniche di microscopia a fluorescenza per il bioimaging delle proteine e dei loro aggregati¹, solo alcune sono state utilizzate per risolvere il loro ordinamento locale all’interno del campione ^2,3. La^microscopia a fluorescenza 4 è stata utilizzata per studiare l’eterogeneità strutturale intrinseca delle sovrastrutture-sferuliti amiloidi. Inoltre, la determinazione quantitativa dell’ordinamento locale all’interno di biostrutture complesse e densamente impacchettate come le sferuliti potrebbe essere risolta utilizzando metodi sensibili alla polarizzazione³. Tuttavia, le tecniche di fluorescenza standard con penetrazione superficiale nei tessuti sono limitate poiché l’utilizzo di lunghezze d’onda UV-VIS per eccitare i fluorofori in vivo porta a un’elevata diffusione della luce tissutale⁵. Inoltre, tale imaging richiede spesso la progettazione e il legame di sonde fluorescenti specifiche a una biomolecola mirata, aumentando così il costo e la quantità di lavoro necessario per eseguire l’imaging.

Recentemente, per affrontare questi problemi, il nostro team ha adattato la microscopia a fluorescenza eccitata a due fotoni sensibile alla polarizzazione (ps-2PFM) per l’imaging label-free di strutture biologiche ^6,7. Ps-2PFM consente di misurare la dipendenza dell’intensità della fluorescenza a due fotoni dalla direzione della polarizzazione lineare del fascio di eccitazione e di analizzare la polarizzazione della fluorescenza emessa⁸. L’implementazione di questa tecnica richiede l’integrazione del percorso di eccitazione standard del microscopio multi-fotone (Figura 1) con una piastra a semionda per controllare il piano di polarizzazione della luce. Quindi, i grafici polari, che descrivono la dipendenza dell’intensità della fluorescenza eccitata a due fotoni dalla polarizzazione del raggio laser di eccitazione, vengono creati dai segnali raccolti da due fotodiodi a valanga, raccogliendo così le due componenti reciprocamente perpendicolari della polarizzazione della fluorescenza.

L’ultimo passaggio è il processo di analisi dei dati, tenendo conto dell’impatto degli elementi ottici, come gli specchi dicroici o un obiettivo ad alta apertura numerica, sulla polarizzazione. A causa della natura del processo a due fotoni, questo metodo fornisce sia una ridotta fotoselezione angolare che una migliore risoluzione assiale, poiché l’eccitazione a due fotoni dei fluorofori al di fuori del piano focale è probabilisticamente limitata. È stato inoltre dimostrato che metodi simili potrebbero essere implementati con successo per l’imaging in vivo di sonde nel vicino infrarosso (NIR) per l’imaging dei tessuti profondi⁹. Ps-2PFM è stato precedentemente applicato a fluorofori di immagine nelle membrane cellulari¹⁰ e DNA^11,12, nonché a marcatori fluorescenti non standard di sistemi biologici, come le nanoparticelle d’oro¹³. Tuttavia, in tutti questi esempi, le informazioni sull’organizzazione delle biomolecole sono state ottenute indirettamente e hanno richiesto un orientamento reciproco predefinito tra un fluoroforo e una biomolecola.

In uno dei nostri recenti articoli, abbiamo dimostrato che la ps-2PFM potrebbe essere applicata con successo per determinare la polarizzazione locale dell’autofluorescenza delle sovrastrutture amiloidi e la fluorescenza dalla tioflavina T, un colorante specifico per l’amiloide, legato alle fibrille amiloidi nelle sferuliti⁶. Inoltre, in un altro, abbiamo dimostrato che ps-2PFM potrebbe essere utilizzato per rilevare l’orientamento delle fibrille amiloidi all’interno delle sferuliti amiloidi in un regime di dimensioni inferiori al micron, che è stato confermato correlandolo con l’imaging al microscopio elettronico a trasmissione (TEM)⁷. Il raggiungimento di questo risultato è stato possibile grazie a i) autofluorescenza intrinseca di sferuliti-amiloidi, quando eccitate con uno o due fotoni, mostrano un’autofluorescenza intrinseca con massimi di emissione situati in un intervallo compreso tra 450 e 500 nm e sezioni d’urto di assorbimento a due fotoni paragonabili ai coloranti fluorescenti standard¹⁴, ii) modelli matematici introdotti in precedenza per descrivere come ps-2PEF di coloranti che marcano membrane biologiche e strutture del DNA potrebbero essere applicati a fluorescenza esibita da sferuliti e coloranti ad essi legati ^8,11,15. Pertanto, prima di procedere con l’analisi, consigliamo vivamente di esaminare la teoria richiesta descritta sia nel testo principale che nelle informazioni di supporto del nostro primo articolo riguardante questo argomento⁶. Qui, presentiamo il protocollo su come applicare la tecnica ps-2PFM per una caratterizzazione strutturale amiloide label-free di sferuliti di insulina bovina.