מיקרוסקופ שני פוטונים רגיש לקיטוב לאפיון מבני עמילואיד ללא תוויות

במהלך העשורים האחרונים, למרות שחלה התפתחות משמעותית של טכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות רבות לדימות ביולוגי של חלבונים וצברים שלהם¹, רק מעטים שימשו כדי לפתור את הסדר המקומי שלהם בתוך הדגימה ^2,3. מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי⁴ שימש לחקר ההטרוגניות המבנית הפנימית של מבני-על עמילואידים-ספרוליטים. יתר על כן, קביעה כמותית של הסדר המקומי בתוך מבנים ביולוגיים מורכבים וצפופים כגון ספרוליטים יכולה להיפתר באמצעות שיטות רגישות לקיטוב³. עם זאת, טכניקות פלואורסצנטיות סטנדרטיות עם חדירה שטחית לרקמות מוגבלות מכיוון ששימוש באורכי גל UV-VIS כדי לעורר פלואורופורים in vivo מוביל לפיזור אור רקמה גבוה⁵. בנוסף, הדמיה כזו דורשת לעתים קרובות תכנון וקשירה של גשושיות פלואורסצנטיות ספציפיות לביומולקולה ממוקדת, ובכך מגדילה את העלות ואת כמות העבודה הדרושה לביצוע הדמיה.

לאחרונה, כדי לטפל בבעיות אלה, הצוות שלנו התאים מיקרוסקופ פלואורסצנטי מעורר שני פוטונים רגישים לקיטוב (ps-2PFM) להדמיה ללא תוויות של מבנים ביולוגיים ^6,7. Ps-2PFM מאפשר למדוד את התלות של עוצמת פלואורסצנטיות של שני פוטונים בכיוון הקיטוב הליניארי של קרן העירור וניתוח הקיטוב של הפלואורסצנטיות הנפלטת⁸. היישום של שיטה זו דורש תוספת של נתיב עירור סטנדרטי של מערך מיקרוסקופ רב-פוטונים (איור 1) עם לוח חצי גל כדי לשלוט במישור קיטוב האור. לאחר מכן, גרפים קוטביים, המתארים את התלות של עוצמת פלואורסצנטיות מעוררת של שני פוטונים בקיטוב של קרן לייזר העירור, נוצרים מאותות שנאספו על ידי שתי פוטודיודות מפולת שלגים, ובכך אוספים את שני המרכיבים המאונכים זה לזה של קיטוב פלואורסצנטי.

השלב האחרון הוא תהליך ניתוח הנתונים, תוך התחשבות בהשפעת האלמנטים האופטיים, כגון מראות דיכרואיות או יעד צמצם מספרי גבוה, על הקיטוב. בגלל אופיו של תהליך שני פוטונים, שיטה זו מספקת הן בחירת צילום זוויתית מופחתת והן רזולוציה צירית משופרת, שכן עירור שני פוטונים של פלואורופורים מחוץ למישור המוקד מוגבל מבחינה הסתברותית. כמו כן הוכח כי שיטות דומות יכולות להיות מיושמות בהצלחה עבור הדמיה in vivo של בדיקות אינפרא אדום קרוב (NIR) עבור דימות רקמות עמוקות⁹. Ps-2PFM יושם בעבר על פלואורופורים של תמונות בקרומי תאים¹⁰ ו-DNA^11,12, כמו גם על סמנים פלואורסצנטיים לא סטנדרטיים של מערכות ביולוגיות, כגון ננו-חלקיקי זהב¹³. עם זאת, בכל הדוגמאות הללו, המידע על ארגון הביומולקולות התקבל בעקיפין ודרש אוריינטציה הדדית מוגדרת מראש בין פלואורופור לביומולקולה.

באחד המאמרים האחרונים שלנו, הראינו כי ps-2PFM יכול להיות מיושם בהצלחה לקביעת הקיטוב המקומי של אוטופלואורסצנטיות של מבני על עמילואיד ופלואורסנציה מתיופלבין T, צבע ספציפי לעמילואיד, הקשור לסיבי עמילואיד בספרוליטים⁶. יתר על כן, במקרה אחר, הוכחנו כי ps-2PFM יכול לשמש כדי לזהות כיוון פיבריל עמילואיד בתוך ספרוליטים עמילואיד במשטר גודל תת-מיקרון, אשר אושר על ידי קורלציה עם דימות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)⁷. ההישג של תוצאה זו התאפשר הודות ל-i) אוטופלואורסנציה פנימית של ספרוליטים-עמילואידים, כאשר הם מעוררים עם פוטון אחד או שניים, מציגים אוטופלואורסצנטיות פנימית עם מקסימום פליטה הממוקם בטווח שבין 450 ל-500 ננומטר ושני חתכי בליעה של שני פוטונים הדומים לצבעים פלואורסצנטיים סטנדרטיים¹⁴, ii) מודלים מתמטיים שהוצגו בעבר כדי לתאר כיצד ps-2PEF של צבעים המסמנים קרומים ביולוגיים ומבני DNA יכולים להיות מיושמים על פלואורסצנטיות המוצגת על ידי ספרוליטים וצבעים הקשורים אליהם ^8,11,15. לכן, לפני שנמשיך בניתוח, אנו ממליצים בחום לעבור על התיאוריה הנדרשת המתוארת בשניהם, הטקסט העיקרי והמידע התומך של המאמר הראשון שלנו בנושא^{זה 6}. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול כיצד ליישם את טכניקת ps-2PFM עבור אפיון מבני עמילואיד ללא תווית של ספרוליטים של אינסולין בקר.