Polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie zur markierungsfreien Amyloid-Strukturcharakterisierung

In den letzten Jahrzehnten wurden zwar zahlreiche fluoreszenzmikroskopische Techniken für die Biobildgebung von Proteinen und ihren Aggregaten^entwickelt 1, aber nur wenige wurden verwendet, um ihre lokale Ordnung innerhalb der Probe aufzulösen ^2,3. Die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie⁴ wurde verwendet, um die intrinsische strukturelle Heterogenität von Amyloid-Superstrukturen-Sphäroliten zu untersuchen. Darüber hinaus konnte die quantitative Bestimmung der lokalen Ordnung in komplexen und dicht gepackten Biostrukturen wie Sphäroliten mit polarisationssensitiven Methoden^{aufgelöst werden 3}. Standard-Fluoreszenztechniken mit oberflächlicher Gewebepenetration sind jedoch begrenzt, da die Verwendung von UV-VIS-Wellenlängen zur Anregung von Fluorophoren in vivo zu einer hohen Gewebelichtstreuung führt⁵. Darüber hinaus erfordert eine solche Bildgebung häufig die Entwicklung und Bindung spezifischer Fluoreszenzsonden an ein Zielbiomolekül, wodurch die Kosten und der Arbeitsaufwand für die Durchführung der Bildgebung erhöht werden.

Um diese Probleme anzugehen, hat unser Team kürzlich die polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenzmikroskopie (ps-2PFM) für die markierungsfreie Abbildung biologischer Strukturen angepasst ^6,7. Ps-2PFM ermöglicht die Messung der Abhängigkeit der Zwei-Photonen-Fluoreszenzintensität von der Richtung der linearen Polarisation des Anregungsstrahls und die Analyse der Polarisation der emittierten Fluoreszenz⁸. Die Implementierung dieser Technik erfordert die Ergänzung des Standard-Multiphotonenmikroskop-Anregungspfads (Abbildung 1) um eine Halbwellenplatte zur Steuerung der Lichtpolarisationsebene. Dann werden Polargraphen, die die Abhängigkeit der Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenzintensität von der Polarisation des Anregungslaserstrahls darstellen, aus Signalen erstellt, die von zwei Avalanche-Photodioden gesammelt werden, und so die beiden zueinander senkrechten Komponenten der Fluoreszenzpolarisation sammeln.

Der letzte Schritt ist der Datenanalyseprozess, bei dem der Einfluss der optischen Elemente, wie z. B. dichroitische Spiegel oder ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur, auf die Polarisation berücksichtigt wird. Aufgrund der Beschaffenheit des Zwei-Photonen-Prozesses bietet diese Methode sowohl eine reduzierte Winkel-Photoselektion als auch eine verbesserte axiale Auflösung, da die Zwei-Photonen-Anregung von Fluorophoren außerhalb der Fokusebene probabilistisch begrenzt ist. Es konnte auch nachgewiesen werden, dass ähnliche Methoden erfolgreich für die In-vivo-Bildgebung von Nahinfrarot-Sonden (NIR) für die Tiefengewebebildgebung eingesetzt werden können⁹. Ps-2PFM wurde zuvor zur Abbildung von Fluorophoren in Zellmembranen¹⁰ und DNA^11,12 sowie von Nicht-Standard-Fluoreszenzmarkern biologischer Systeme, wie z. B. Goldnanopartikeln¹³, eingesetzt. In all diesen Beispielen wurde die Information über die Organisation von Biomolekülen jedoch indirekt gewonnen und erforderte eine vordefinierte gegenseitige Orientierung zwischen einem Fluorophor und einem Biomolekül.

In einer unserer jüngsten Arbeiten haben wir gezeigt, dass ps-2PFM erfolgreich zur Bestimmung der lokalen Polarisation der Autofluoreszenz von Amyloid-Überstrukturen und der Fluoreszenz von Thioflavin T, einem Amyloid-spezifischen Farbstoff, der an Amyloidfibrillen in Sphäroliten gebunden ist, eingesetzt werden kann⁶. Darüber hinaus haben wir in einer anderen Studie bewiesen, dass ps-2PFM verwendet werden kann, um die Orientierung von Amyloidfibrillen in Amyloid-Sphäroliten in einem Submikrometer-Größenbereich zu detektieren, was durch Korrelation mit der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt wurde⁷. Das Erreichen dieses Ergebnisses war möglich dank i) der intrinsischen Autofluoreszenz von Sphärolith-Amyloiden, die mit einem oder zwei Photonen angeregt werden, eine intrinsische Autofluoreszenz mit Emissionsmaxima in einem Bereich von 450 bis 500 nm und Zwei-Photonen-Absorptionsquerschnitten aufweisen, die mit Standard-Fluoreszenzfarbstoffen vergleichbar sind¹⁴, ii) mathematische Modelle, die zuvor eingeführt wurden, um zu beschreiben, wie ps-2PEF von Farbstoffen, die biologische Membranen und DNA-Strukturen markieren, angewendet werden könnte Fluoreszenz von Sphäroliten und an sie gebundenen Farbstoffen ^8,11,15. Bevor wir mit der Analyse fortfahren, empfehlen wir daher dringend, die erforderliche Theorie durchzusehen, die sowohl im Haupttext als auch in den unterstützenden Informationen unseres ersten Artikels zu diesem Thema^{beschrieben ist 6}. In dieser Arbeit stellen wir das Protokoll zur Anwendung der ps-2PFM-Technik für eine markierungsfreie Amyloid-Strukturcharakterisierung von bovinen Insulinsphäroliten vor.