Polarisatiegevoelige twee-fotonmicroscopie voor een labelvrije structurele karakterisering van amyloïden

In de afgelopen decennia, hoewel er een aanzienlijke ontwikkeling is geweest van talrijke fluorescentiemicroscopietechnieken voor bioimaging van eiwitten en hun aggregaten¹, zijn er slechts enkele gebruikt om hun lokale ordening binnen het monster op te lossen ^2,3. Fluorescentie lifetime imaging microscopie⁴ werd gebruikt om de intrinsieke structurele heterogeniteit van amyloïde superstructuren-sferulieten te bestuderen. Bovendien zou kwantitatieve bepaling van de lokale ordening in complexe en dicht opeengepakte biostructuren zoals sferulieten kunnen worden opgelost met behulp van polarisatiegevoelige methoden³. Standaard fluorescentietechnieken met oppervlakkige weefselpenetratie zijn echter beperkt, aangezien het gebruik van UV-VIS-golflengten om fluoroforen in vivo te exciteren leidt tot een hoge verstrooiing van weefsellicht⁵. Bovendien vereist dergelijke beeldvorming vaak het ontwerpen en binden van specifieke fluorescerende sondes aan een gericht biomolecuul, waardoor de kosten en de hoeveelheid werk die nodig is om beeldvorming uit te voeren, toenemen.

Om deze problemen aan te pakken, heeft ons team onlangs de polarisatiegevoelige twee-foton geëxciteerde fluorescentiemicroscopie (ps-2PFM) aangepast voor labelvrije beeldvorming van biologische structuren ^6,7. Ps-2PFM maakt het mogelijk om de afhankelijkheid van de intensiteit van de fluorescentie van twee fotonen te meten van de richting van de lineaire polarisatie van de excitatiestraal en de polarisatie van de uitgezonden fluorescentie^{te analyseren 8}. De implementatie van deze techniek vereist aanvulling van het standaard excitatiepad van de multi-fotonenmicroscoopopstelling (Figuur 1) met een halfgolfplaat om het lichtpolarisatievlak te regelen. Vervolgens worden polaire grafieken, die de afhankelijkheid van de intensiteit van de geëxciteerde fluorescentie met twee fotonen van de polarisatie van de excitatielaserstraal weergeven, gemaakt van signalen die worden verzameld door twee lawinefotodiodes, waardoor de twee, onderling loodrecht op elkaar staande componenten van fluorescentiepolarisatie worden verzameld.

De laatste stap is het data-analyseproces, waarbij rekening wordt gehouden met de impact van de optische elementen, zoals dichroïsche spiegels of een objectief met een hoge numerieke apertuur, op polarisatie. Vanwege de aard van het twee-fotonproces biedt deze methode zowel een verminderde hoekfotoselectie als een verbeterde axiale resolutie, aangezien de excitatie van fluoroforen met twee fotonen buiten het brandpuntsvlak waarschijnlijk beperkt is. Het werd ook bewezen dat soortgelijke methoden met succes konden worden geïmplementeerd voor in vivo beeldvorming van nabij-infraroodsondes (NIR)^{voor beeldvorming} van diep weefsel9. Ps-2PFM is eerder toegepast op beeldfluoroforen in celmembranen¹⁰ en DNA^11,12, evenals niet-standaard fluorescerende markers van biologische systemen, zoals gouden nanodeeltjes¹³. In al deze voorbeelden werd de informatie over de organisatie van biomoleculen echter indirect verkregen en vereiste een vooraf gedefinieerde wederzijdse oriëntatie tussen een fluorofoor en een biomolecuul.

In een van onze recente artikelen hebben we aangetoond dat ps-2PFM met succes kan worden toegepast voor het bepalen van de lokale polarisatie van de autofluorescentie van amyloïde superstructuren en fluorescentie van thioflavine T, een amyloïde-specifieke kleurstof, gebonden aan amyloïde fibrillen in sferulieten⁶. Bovendien hebben we in een andere bewezen dat ps-2PFM kan worden gebruikt om de oriëntatie van amyloïde fibrillen in amyloïde sferulieten te detecteren in een regime van submicrongrootte, wat werd bevestigd door het te correleren met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) beeldvorming⁷. Het bereiken van dit resultaat was mogelijk dankzij i) intrinsieke autofluorescentie van sferulieten en amyloïden, wanneer ze worden geëxciteerd met één of twee fotonen, intrinsieke autofluorescentie vertonen met emissiemaxima in een bereik van 450 tot 500 nm en absorptiedoorsneden van twee fotonen die vergelijkbaar zijn met standaard fluorescerende kleurstoffen¹⁴, ii) wiskundige modellen die eerder zijn geïntroduceerd om te beschrijven hoe ps-2PEF van kleurstoffen die biologische membranen en DNA-structuren labelen, kunnen worden toegepast op fluorescentie vertoond door sferulieten en kleurstoffen die eraan zijn gebonden ^8,11,15. Daarom raden we ten zeerste aan om, voordat we verder gaan met de analyse, de vereiste theorie door te nemen die wordt beschreven in zowel de hoofdtekst als de ondersteunende informatie van ons eerste artikel over dit onderwerp⁶. Hier presenteren we het protocol voor het toepassen van de ps-2PFM-techniek voor een labelvrije amyloïde structurele karakterisering van runderinsuline sferulieten.