مجهر ثنائي الفوتون حساس للاستقطاب لتوصيف هيكلي أميلويد خال من الملصقات
Summary
تصف هذه الورقة كيف يمكن تطبيق المجهر ثنائي الفوتون الحساس للاستقطاب لتوصيف التنظيم المحلي داخل الهياكل الفوقية الأميلويد الخالية من التسمية. كما يصف كيفية تحضير العينة وقياسها ، وتجميع الإعداد المطلوب ، وتحليل البيانات للحصول على معلومات حول التنظيم المحلي لألياف الأميلويد.
Abstract
بالمقارنة مع نظيره ذو الفوتون الواحد ، فإن الإثارة ثنائية الفوتون مفيدة لتجارب التصوير الحيوي بسبب انخفاض السمية الضوئية ، واختراق الأنسجة الأعمق ، والتشغيل الفعال في الأنظمة المزدحمة ، وتقليل الانتقاء الضوئي الزاوي للفلوروفور. وبالتالي ، فإن إدخال تحليل الاستقطاب في المجهر الفلوري ثنائي الفوتون (2PFM) يوفر تحديدا أكثر دقة للتنظيم الجزيئي في عينة مقارنة بطرق التصوير القياسية القائمة على العمليات البصرية الخطية. في هذا العمل ، نركز على 2PFM الحساسة للاستقطاب (ps-2PFM) وتطبيقها في تحديد الترتيب الجزيئي داخل الهياكل الحيوية المعقدة – كرويات الأميلويد. غالبا ما يتم تشخيص الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر أو باركنسون من خلال الكشف عن مجاميع بروتين الأميلويد التي تشكلت بسبب ضعف عملية اختلال البروتين. يؤدي استكشاف هيكلها إلى فهم أفضل لمسار إنشائها وبالتالي تطوير طرق تشخيص أكثر حساسية. تقدم هذه الورقة ps-2PFM التي تم تكييفها لتحديد ترتيب الألياف المحلية داخل كرويات الأنسولين البقري ومجاميع البروتين النشواني الكروي. علاوة على ذلك ، نثبت أن التقنية المقترحة يمكن أن تحل التنظيم ثلاثي الأبعاد للألياف داخل الكروية.
Introduction
على مدى العقود الماضية ، على الرغم من حدوث تطور كبير للعديد من تقنيات الفحص المجهري الفلوري للتصوير الحيوي للبروتينات ومجاميعها1 ، فقد تم استخدام عدد قليل فقط لحل ترتيبها المحلي داخل العينة 2,3. تم استخدام الفحص المجهري للتصوير مدى الحياةالفلوري 4 لدراسة عدم التجانس الهيكلي الجوهري للهياكل الفوقية الأميلويد الكروية. علاوة على ذلك ، يمكن حل التحديد الكمي للترتيب المحلي داخل الهياكل الحيوية المعقدة والمعبأة بكثافة مثل spherulites باستخدام طرق حساسة للاستقطاب3. ومع ذلك ، فإن تقنيات التألق القياسية مع اختراق الأنسجة السطحية محدودة لأن استخدام الأطوال الموجية للأشعة المرئية وفوق البنفسجية لإثارة الفلوروفورات في الجسم الحي يؤدي إلى تشتت ضوء الأنسجةالعالي 5. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يتطلب هذا التصوير تصميم وربط مجسات فلورية محددة بجزيء حيوي مستهدف ، وبالتالي زيادة تكلفة ومقدار العمل اللازم لإجراء التصوير.
في الآونة الأخيرة ، لمعالجة هذه المشكلات ، قام فريقنا بتكييف الفحص المجهري الفلوري المثار ثنائي الفوتون الحساس للاستقطاب (ps-2PFM) للتصوير الخالي من الملصقات للهياكل البيولوجية 6,7. يسمح Ps-2PFM بقياس اعتماد شدة مضان الفوتون على اتجاه الاستقطاب الخطي لحزمة الإثارة وتحليل استقطاب التألق المنبعث8. يتطلب تنفيذ هذه التقنية تكملة مسار إثارة إعداد المجهر متعدد الفوتون القياسي (الشكل 1) بلوحة نصف موجة للتحكم في مستوى استقطاب الضوء. بعد ذلك ، يتم إنشاء الرسوم البيانية القطبية ، التي تصور اعتماد شدة التألق المثارة ثنائية الفوتون على استقطاب شعاع ليزر الإثارة ، من الإشارات التي تم جمعها بواسطة اثنين من الثنائيات الضوئية للانهيار الجليدي ، وبالتالي جمع المكونين المتعامدين بشكل متبادل لاستقطاب التألق.
الخطوة الأخيرة هي عملية تحليل البيانات ، مع مراعاة تأثير العناصر البصرية ، مثل المرايا ثنائية اللون أو هدف الفتحة العددية العالية ، على الاستقطاب. نظرا لطبيعة عملية الفوتونين ، توفر هذه الطريقة كلا من اختيار الصورة الزاوي المنخفض والدقة المحورية المحسنة ، حيث أن إثارة الفوتون الثنائي للفلوروفورات خارج المستوى البؤري محدودة على الأرجح. وقد ثبت أيضا أنه يمكن تنفيذ طرق مماثلة بنجاح للتصوير في الجسم الحي لمجسات الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) لتصوير الأنسجة العميقة9. تم تطبيق Ps-2PFM سابقا على صور الفلوروفورات في أغشية الخلايا10 و DNA11,12 ، بالإضافة إلى علامات الفلورسنت غير القياسية للأنظمة البيولوجية ، مثل جسيمات الذهبالنانوية 13. ومع ذلك ، في كل هذه الأمثلة ، تم الحصول على المعلومات حول تنظيم الجزيئات الحيوية بشكل غير مباشر وتتطلب توجها متبادلا محددا مسبقا بين الفلوروفور والجزيء الحيوي.
في إحدى أوراقنا الأخيرة ، أظهرنا أنه يمكن تطبيق ps-2PFM بنجاح لتحديد الاستقطاب المحلي للتألق الذاتي للهياكل الفوقية للأميلويد والتألق من Thioflavin T ، وهي صبغة خاصة بالأميلويد ، مرتبطة بألياف الأميلويد في كروية6. علاوة على ذلك ، في واحد آخر ، أثبتنا أنه يمكن استخدام ps-2PFM للكشف عن اتجاه ليفي الأميلويد داخل كرويات الأميلويد في نظام حجم دون ميكرون ، وهو ما تم تأكيده من خلال ربطه بالتصوير المجهري الإلكتروني (TEM)7. كان تحقيق هذه النتيجة ممكنا بفضل أ) التألق الذاتي الجوهري للكرويات-الأميلويدات ، عند إثارته إما بفوتون واحد أو فوتونين ، يظهر تألقا ذاتيا جوهريا مع الحد الأقصى للانبعاثات الموجود في نطاق من 450 إلى 500 نانومتر ومقطع عرضي لامتصاص الفوتون يمكن مقارنته بالأصباغ الفلورية القياسية14 ، ii) النماذج الرياضية التي تم تقديمها سابقا لوصف كيفية تطبيق ps-2PEF للأصباغ التي تضع علامات على الأغشية البيولوجية وهياكل الحمض النووي مضان أظهرته كرويات وأصباغ مرتبطة بها8،11،15. وبالتالي ، قبل الشروع في التحليل ، نوصي بشدة بالنظر في النظرية المطلوبة الموضحة في كل من النص الرئيسي والمعلومات الداعمة لورقتنا الأولى المتعلقة بهذا الموضوع6. هنا ، نقدم بروتوكول كيفية تطبيق تقنية ps-2PFM للتوصيف الهيكلي للأميلويد الخالي من الملصقات لكويات الأنسولين البقري.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد الفحص المجهري ثنائي الفوتون الحساس للاستقطاب أداة قيمة لدراسة الترتيب المحلي للألياف داخل الهياكل الفوقية الأميلويد ، والتي تتطلب تعديلات صغيرة فقط على الإعداد القياسي متعدد الفوتونات. نظرا لأنه يعمل على الظواهر البصرية غير الخطية ، يمكن تحقيق تقليل اختيار الصورة الزاوية والدقة ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مشروع Sonata Bis 9 (2019/34 / E / ST5 / 00276) بتمويل من المركز الوطني للعلوم في بولندا.
Materials
| Sample preparation | |||
| Coverslips, 24 x 24 mm | Chemland | 04-298.202.04 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 6522 | Slide mountant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene | Chemland | 02-63102 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | Used for spherulite incubation | |
| HLP 5UV Water purification system | Hydrolab | Source of dionized water used in sample preparation | |
| Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), | Sigma-Aldrich | 30721-M | |
| Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 270474 | |
| Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm | Chemland | 04-296.202.09 | |
| Olympus BX60 | Olympus | Polarized Optical Microscope used in Figure 2 | |
| PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 | Chemland | VIT131097 | |
| Microscope ps-2PFM setup | |||
| Chameleon Ultra II | Coherent | ||
| FELH0800 – Ø25.0 mm Longpass Filter | Thorlabs | ||
| FESH0700 – Ø25.0 mm Shortpass Filter | Thorlabs | ||
| IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes | ID Quantique | ||
| Multiphoton short-pass emission filter 720 nm | Semrock | ||
| Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm | Thorlabs | ||
| Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA | Nikon | ||
| piezo 3D stage | Piezosystem Jena | ||
| Polarizing Beamsplitter | Thorlabs | ||
| S130C – Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 – 1100 nm, 500 mW | Thorlabs | ||
| Software | |||
| LabView 2018 | National Instruments | Version 18.0.1f2 | |
| Matplotlib library | Version 3.3.2 | ||
| NumPy library | Version 1.19.2 | ||
| SciPy library | Version 1.5.2 | ||
| Spyder Python 3 IDE | Version 4.1.5 |
References
- Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S., Giraldo, J., Ciruela, F. . Progress in Molecular Biology and Translational Science. 169, 1-41 (2020).
- Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging. Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).
- Duboisset, J., et al. Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).
- De Luca, G., et al. Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly. Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging. The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).
- Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. Amyloid fibrils in superstructures – local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence. Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).
- Le Floc’h, V., Brasselet, S., Roch, J. -. F., Zyss, J. Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).
- Chen, C., et al. In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer’s disease mouse model. ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).
- Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).
- Mojzisova, H., et al. Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA. Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).
- Olesiak-Banska, J., et al. Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis. Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).
- Olesiak-Banska, J., et al. Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix. Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).
- Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids. The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).
- Brasselet, S., Mély, Y., Duportail, G., et al. . Fluorescent Methods to Study Biological Membranes. , 311-337 (2013).
- Krebs, M. R., et al. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).
- Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging. Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).
- Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy. Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Ferrand, P., et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores. Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).
- Chipman, R. A. Depolarization index and the average degree of polarization. Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).
- de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680–1050 nm wavelength range. Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).
- Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy. Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611 (2019).
- Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation. Physical Review A. 85 (4), 043829 (2012).
- Loksztejn, A., Dzwolak, W. Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study. Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).
