Aufbereitung von harten Palmsamen für die matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisations-Imaging-Massenspektrometrie-Analyse
Summary
Dieses Protokoll zielte darauf ab, detaillierte Leitlinien für die Vorbereitung von harten Saatgutprobenschnitten mit niedrigem Wassergehalt für die MALDI-IMS-Analyse zu beschreiben, die ursprüngliche Verteilung und Häufigkeit der Analyten beizubehalten und eine qualitativ hochwertige Signal- und räumliche Auflösung bereitzustellen.
Abstract
Die Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-/Ionisations-Imaging-Massenspektrometrie (MALDI-IMS) wird angewendet, um Verbindungen in ihrer natürlichen Umgebung zu identifizieren. Derzeit wird MALDI-IMS häufig in der klinischen Analyse eingesetzt. Dennoch gibt es eine hervorragende Perspektive, um diese Technik besser anzuwenden, um die physiologischen Informationen chemischer Verbindungen in Pflanzengeweben zu verstehen. Die Vorbereitung kann jedoch für bestimmte Proben aus botanischen Materialien eine Herausforderung darstellen, da MALDI-IMS dünne Scheiben (12-20 μm) für eine angemessene Datenerfassung und erfolgreiche Analyse benötigt. In diesem Sinne haben wir zuvor ein Probenvorbereitungsprotokoll entwickelt, um dünne Schnitte von harten Samen von Euterpe oleracea (Açaí-Palme) zu erhalten, die ihre molekulare Kartierung durch MALDI-IMS ermöglichen.
Hier zeigen wir, dass das entwickelte Protokoll für die Herstellung anderer Samen derselben Gattung geeignet ist. Kurz gesagt, das Protokoll basierte darauf, die Samen 24 Stunden lang in deionisiertes Wasser zu tauchen, Proben mit Gelatine einzubetten und sie in einem akklimatisierten Kryostaten zu schneiden. Für die Matrixabscheidung wurde dann eine xy-Bewegungsplattform mit einem Elektrospray-Ionisationsnadelspray (ESI) unter Verwendung einer 1:1 (v/v) 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) und einer Methanollösung mit 0,1% Trifluoressigsäure bei 30 mg/ml gekoppelt. Die Samendaten von E. precatoria und E. edulis wurden mit Hilfe von Software verarbeitet, um ihre Metabolitenmuster abzubilden.
Hexose-Oligomere wurden in Probenscheiben kartiert, um die Angemessenheit des Protokolls für diese Proben zu beweisen, da bekannt ist, dass diese Samen große Mengen an Mannan, einem Polymer der Hexose-Mannose, enthalten. Als Ergebnis wurden Peaks von Hexose-Oligomeren, dargestellt durch [M + K]+ Addukte von (Δ = 162 Da), identifiziert. So ermöglichte das zuvor speziell für E. oleracea-Samen entwickelte Probenvorbereitungsprotokoll auch die MALDI-IMS-Analyse von zwei weiteren harten Palmsamen. Kurz gesagt, die Methode könnte ein wertvolles Werkzeug für die Erforschung der Morphoanatomie und Physiologie botanischer Materialien sein, insbesondere aus schnittfesten Proben.
Introduction
Die Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Imaging-Massenspektrometrie (MALDI-IMS) ist eine leistungsfähige Methode, die eine zweidimensionale Zuordnung von Biomolekülen ermöglicht, eine ungezielte Untersuchung ionisierbarer Verbindungen ermöglicht und deren räumliche Verteilung, insbesondere in biologischen Proben, bestimmt 1,2. Seit zwei Jahrzehnten ermöglicht diese Technik den gleichzeitigen Nachweis und die Identifizierung von Lipiden, Peptiden, Kohlenhydraten, Proteinen, anderen Metaboliten und synthetischen Molekülen wie therapeutischen Medikamenten 3,4. MALDI-IMS erleichtert die chemische Analyse in einer Gewebeprobenoberfläche ohne Extraktions-, Reinigungs-, Trenn-, Markierungs- oder Färbemittel biologischer Proben. Für eine erfolgreiche Analyse ist jedoch die Probenvorbereitung ein entscheidender Schritt in dieser Technik, insbesondere in Pflanzengeweben, die aufgrund der Umweltakklimatisierung spezialisiert und zu weit verbreiteten komplexen Organen modifiziert werden5.
Aufgrund der inhärenten physikalisch-chemischen Eigenschaften des Pflanzengewebes besteht die Notwendigkeit eines angepassten Protokolls, das den Anforderungen der MALDI-IMS-Analyse entspricht und die ursprüngliche Form des Gewebes während der Schnittvorbereitung bewahrt 6,7. Bei unkonventionellen Proben, wie z. B. Samen, sind etablierte Protokolle8 nicht anwendbar, da diese Gewebe starre Zellwände und einen geringen Wassergehalt aufweisen, was leicht zu einer Fragmentierung des Schnitts und zu einer Delokalisierung von Verbindungenführen kann 9.
Unsere Forschungsgruppe hat experimentelle Daten zur molekularen Kartierung und ein angepasstes Protokoll für die MALDI-IMS-Analyse von Açaí-Samen (Euterpe oleracea Mart.) 10,11,12 veröffentlicht, bei denen es sich um ein Nebenprodukt handelt, das bei der Herstellung des rentablen Açaí-Zellstoffs 13 in großen Mengen anfällt. Die Idee war, ein Protokoll für die In-situ-Kartierung verschiedener Metaboliten in Açaí-Saatgut zu entwickeln, um mögliche Verwendungsmöglichkeiten für diese landwirtschaftlichen Abfälle vorzuschlagen, die derzeit nicht kommerziell erforscht werden. Aufgrund der Resistenz des Açaí-Saatguts war es jedoch notwendig, ein maßgeschneidertes Protokoll zu erstellen, um eine ordnungsgemäße Probentrennung aus der MALDI-IMS-Analyse zu erhalten.
In diesem Zusammenhang hat das wirtschaftlich wichtige Açaí-Fruchtfleisch die zunehmende Vermarktung anderer Früchte der Gattung Euterpe mit ähnlichen sensorischen Eigenschaften motiviert. Die beiden aufstrebenden Palmenfrüchte, die in industriellem Maßstab als Alternative zu açaí14,15 angebaut wurden, sind E. precatoria (bekannt als açaí-do-amazonas), die im Amazonas-Trockengebiet wächst, und E. edulis (bekannt als juçara), die typisch für den Atlantischen Regenwald ist. Dennoch führt der Verzehr von Açaí-do-Amazonas und Juçara zur gleichen Anhäufung von resistentem und ungenießbarem Saatgut, das nicht genutzt wird und bisher nicht hinsichtlich seiner detaillierten chemischen Zusammensetzung untersucht wurde.
So zeigen wir hier, dass das zuvor entwickelte Protokoll mit wenigen Anpassungen verwendet werden kann, um E . precatoria – und E. edulis-Samen für die molekulare Kartierung durch MALDI-IMS zu analysieren, was sich als leistungsfähiges Werkzeug erweist, das zur Analyse der Zusammensetzung dieser Ressourcen verwendet werden kann und helfen kann, ihre potenziellen biotechnologischen Anwendungen zu bestimmen. Darüber hinaus kann die hier bereitgestellte detaillierte Beschreibung anderen mit ähnlichen Schwierigkeiten bei der Vorbereitung widerstandsfähiger Materialien für die MALDI-IMS-Analyse helfen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pflanzen bestehen aus spezialisierten Geweben für bestimmte biochemische Funktionen. Daher muss das Probenvorbereitungsprotokoll für MALDI-IMS entsprechend verschiedenen Pflanzengeweben mit spezifischen physikalisch-chemischen Eigenschaften entworfen werden, da die Proben ihre ursprüngliche Analytverteilung und -häufigkeit für eine qualitativ hochwertige Signal- und räumliche Auflösung beibehalten müssen8.
Vor der MALDI-IMS-Analyse geht es in erster Linie darum,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Serrapilheira-Institut (Serra-1708-15009) und der Carlos Chagas Filho-Stiftung zur Unterstützung der Forschung im Bundesstaat Rio de Janeiro (FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021) finanziert. Das Serrapilheira-Institut und der Nationale Rat für wissenschaftliche und technologische Entwicklung (CNPq) gewährten Stipendien für Dr. Felipe Lopes Brum und Dr. Gabriel R. Martins (Institutional Capacity Building Program/INT/MCTI). Die Koordination zur Verbesserung des Hochschulpersonals (CAPES) wird für die Gewährung eines Master-Stipendiums für Herrn Davi M. M. C. da Silva gewürdigt. Das Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ) wird für die mit MALDI-IMS-Analysen erbrachten Dienstleistungen ausgezeichnet, und Herrn Alan Menezes do Nascimento und dem Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT), finanziert durch den MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ-Zuschuss Nr. 442604/2019, wird für die Analyse der elementaren Zusammensetzung gedankt.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81320 | |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 149357 | |
| APCI needle | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 602193 | |
| AxiDraw V3 xy motion platform | Evil Mad Scientist, CA, USA | 2510 | |
| Carbon double-sided conductive tape | |||
| Compass Data Analysis software | creation of mass list | ||
| Compressed air | |||
| copper double-faced adhesive tape | 3M, USA | 1182-3/4"X18YD | |
| Cryostat CM 1860 UV | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | ||
| Diamond Wafering Blade 15 HC | |||
| Everhart-Thornley detector | |||
| FlexImaging | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | image acquisition | |
| FTMS Processing | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | data calibration | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma Aldrich Co, MO, USA | G9391 | |
| High Profile Microtome Blades Leica 818 | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | 0358 38926 | |
| indium tin oxide coated glass slide | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8237001 | |
| Inkscape | Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA | ||
| IsoMet 1000 precision cutter | Buehler, Illinois, USA | ||
| Methanol | J.T.Baker | 9093-03 | |
| Mili-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
| Oil vacuum pump | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound | Fisher HealthCare, Texas, USA | 4585 | |
| Parafilm "M" Sealing Film | Amcor | HS234526B | |
| Quanta 450 FEG | FEI Co, Hillsboro, OR, USA | ||
| SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Software INCA Suite 4.14 V | Oxford Instruments, Ableton, UK | ||
| Solarix 7T | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Syringe pump | kdScientific, MA, USA | 78-9100K | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 302031 | |
| X-Max spectrometer | Oxford Instruments, Ableton, UK |
References
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