Bereiding van harde palmzaden voor matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie-beeldvorming massaspectrometrie-analyse
Summary
Dit protocol was bedoeld om gedetailleerde richtlijnen te beschrijven voor de voorbereiding van secties van harde zaadmonsters met een laag watergehalte voor MALDI-IMS-analyse, waarbij de oorspronkelijke verdeling en overvloed van analyten behouden blijft en signaal- en ruimtelijke resolutie van hoge kwaliteit wordt geboden.
Abstract
Matrix-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) wordt toegepast om verbindingen in hun oorspronkelijke omgeving te identificeren. Momenteel wordt MALDI-IMS vaak gebruikt in klinische analyses. Toch bestaat er een uitstekend perspectief om deze techniek beter toe te passen om de fysiologische informatie van chemische verbindingen in plantenweefsels te begrijpen. De voorbereiding kan echter een uitdaging zijn voor specifieke monsters van botanisch materiaal, aangezien MALDI-IMS dunne plakjes (12-20 μm) nodig heeft voor de juiste gegevensverzameling en succesvolle analyse. In die zin hebben we eerder een protocol voor monstervoorbereiding ontwikkeld om dunne secties van Euterpe oleracea (açaí palm) harde zaden te verkrijgen, waardoor ze moleculair in kaart kunnen worden gebracht door MALDI-IMS.
Hier laten we zien dat het ontwikkelde protocol geschikt is voor het bereiden van andere zaden uit hetzelfde geslacht. In het kort was het protocol gebaseerd op het onderdompelen van de zaden in gedeïoniseerd water gedurende 24 uur, het inbedden van monsters met gelatine en het verdelen ervan in een geacclimatiseerde cryostaat. Vervolgens werd voor matrixafzetting een xy-bewegingsplatform gekoppeld aan een elektrospray-ionisatie (ESI) naaldspray met behulp van een 1:1 (v/v) 2,5-dihydroxybenzoëzuur (DHB) en methanoloplossing met 0,1% trifluorazijnzuur bij 30 mg/ml. E. precatoria en E. edulis zaadgegevens werden verwerkt met behulp van software om hun metabolietpatronen in kaart te brengen.
Hexose-oligomeren werden in kaart gebracht in plakjes monsters om de geschiktheid van het protocol voor die monsters aan te tonen, aangezien bekend is dat die zaden grote hoeveelheden mannan bevatten, een polymeer van de hexose-mannose. Als gevolg hiervan werden pieken van hexose-oligomeren, vertegenwoordigd door [M + K]+ adducten van (Δ = 162 Da), geïdentificeerd. Zo maakte het monstervoorbereidingsprotocol, dat eerder op maat was ontwikkeld voor E. oleracea-zaden , ook MALDI-IMS-analyse van twee andere harde palmzaden mogelijk. Kortom, de methode zou een waardevol hulpmiddel kunnen zijn voor onderzoek naar de morfo-anatomie en fysiologie van botanische materialen, met name uit snijbestendige monsters.
Introduction
Matrix-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) is een krachtige methode die tweedimensionale toewijzing van biomoleculen mogelijk maakt, ongericht onderzoek van ioniseerbare verbindingen mogelijk maakt en hun ruimtelijke verdeling bepaalt, vooral in biologische monsters 1,2. Al twee decennia lang maakt deze techniek de gelijktijdige detectie en identificatie mogelijk van lipiden, peptiden, koolhydraten, eiwitten, andere metabolieten en synthetische moleculen zoals therapeutische geneesmiddelen 3,4. MALDI-IMS vergemakkelijkt chemische analyse in een weefselmonsteroppervlak zonder extractie, zuivering, scheiding, etikettering of kleurstoffen van biologische monsters. Voor een succesvolle analyse is een cruciale stap in deze techniek echter de monstervoorbereiding, met name in plantenweefsels, die gespecialiseerd zijn en gemodificeerd zijn tot wijdverspreide complexe organen als gevolg van omgevingsacclimatisatie5.
Vanwege de inherente fysisch-chemische eigenschappen van plantenweefsel is er behoefte aan een aangepast protocol om te voldoen aan de vereisten van MALDI-IMS-analyse en om de oorspronkelijke vorm van het weefsel te behouden tijdens de voorbereiding van de secties 6,7. In het geval van onconventionele monsters, zoals zaden, zijn vastgestelde protocollen8 niet van toepassing omdat deze weefsels stijve celwanden en een laag watergehalte hebben, wat gemakkelijk kan leiden tot fragmentatie van secties en kan leiden tot delokalisatie van verbindingen9.
Onze onderzoeksgroep heeft experimentele gegevens gepubliceerd over moleculaire kartering en een aangepast protocol voor MALDI-IMS-analyse van açaí (Euterpe oleracea Mart.) zaad 10,11,12, een bijproduct dat in grote hoeveelheden wordt gegenereerd tijdens de productie van de verhuurbare açaí-pulp13. Het idee was om een protocol te ontwikkelen voor het in situ in kaart brengen van verschillende metabolieten in açaí-zaden, om mogelijke toepassingen voor dit landbouwafval voor te stellen die momenteel niet commercieel worden onderzocht. Vanwege de resistentie van het açaí-zaad was het echter noodzakelijk om een protocol op maat te maken om de juiste monstersecties te verkrijgen van MALDI-IMS-analyse.
In deze context heeft de economisch belangrijke açaí-pulp geleid tot de toenemende commercialisering van andere vruchten van palmbomen van het geslacht Euterpe met vergelijkbare sensorische kenmerken. De twee opkomende vruchten van palmbomen die op industriële schaal zijn geproduceerd als alternatief voor açaí14,15 zijn E. precatoria (bekend als açaí-do-amazonas), die groeit in het droge gebied van de Amazone, en E. edulis (bekend als juçara), die typisch is voor het Atlantische Woud. Desalniettemin leidt de consumptie van açaí-do-amazonas en juçara tot dezelfde opeenhoping van resistente en oneetbare zaden die niet worden gebruikt en tot nu toe niet zijn bestudeerd met betrekking tot hun gedetailleerde chemische samenstelling.
Zo tonen we hier aan dat het eerder bedachte protocol, met weinig aanpassingen, kan worden gebruikt om E. precatoria en E. edulis-zaden te analyseren voor moleculaire kartering door MALDI-IMS, wat een krachtig hulpmiddel blijkt te zijn dat kan worden gebruikt voor analyse van de samenstelling van deze bronnen en kan helpen bij het bepalen van hun potentiële biotechnologische toepassingen. Bovendien kan de gedetailleerde beschrijving die hier wordt gegeven, anderen helpen met soortgelijke problemen bij het voorbereiden van resistente materialen voor MALDI-IMS-analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Planten zijn samengesteld uit gespecialiseerde weefsels voor specifieke biochemische functies. Daarom moet het monstervoorbereidingsprotocol voor MALDI-IMS worden ontworpen op basis van verschillende plantenweefsels met specifieke fysisch-chemische eigenschappen, aangezien monsters hun oorspronkelijke analytverdeling en -overvloed moeten behouden voor een signaal van hoge kwaliteit en een ruimtelijke resolutie8.
Voorafgaand aan de MALDI-IMS-analyse is de primaire overwe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door het Serrapilheira Instituut (Serra-1708-15009) en de Carlos Chagas Filho Foundation for Supporting Research in the State of Rio de Janeiro (FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021). Het Serrapilheira Instituut en de Nationale Raad voor Wetenschappelijke en Technologische Ontwikkeling (CNPq) hebben beurzen toegekend aan Dr. Felipe Lopes Brum en Dr. Gabriel R. Martins (Institutional Capacity Building Program/INT/MCTI). De Coördinatie voor de Verbetering van het Personeel in het Hoger Onderwijs (CAPES) wordt erkend voor het toekennen van een Masterbeurs voor de heer Davi M. M. C. da Silva. Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ) wordt erkend voor de diensten die worden geleverd met MALDI-IMS-analyses, en de heer Alan Menezes do Nascimento en het Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT), gefinancierd door MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ-subsidie nr. 442604/2019, worden bedankt voor de elementaire samenstellingsanalyse.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81320 | |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 149357 | |
| APCI needle | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 602193 | |
| AxiDraw V3 xy motion platform | Evil Mad Scientist, CA, USA | 2510 | |
| Carbon double-sided conductive tape | |||
| Compass Data Analysis software | creation of mass list | ||
| Compressed air | |||
| copper double-faced adhesive tape | 3M, USA | 1182-3/4"X18YD | |
| Cryostat CM 1860 UV | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | ||
| Diamond Wafering Blade 15 HC | |||
| Everhart-Thornley detector | |||
| FlexImaging | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | image acquisition | |
| FTMS Processing | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | data calibration | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma Aldrich Co, MO, USA | G9391 | |
| High Profile Microtome Blades Leica 818 | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | 0358 38926 | |
| indium tin oxide coated glass slide | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8237001 | |
| Inkscape | Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA | ||
| IsoMet 1000 precision cutter | Buehler, Illinois, USA | ||
| Methanol | J.T.Baker | 9093-03 | |
| Mili-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
| Oil vacuum pump | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound | Fisher HealthCare, Texas, USA | 4585 | |
| Parafilm "M" Sealing Film | Amcor | HS234526B | |
| Quanta 450 FEG | FEI Co, Hillsboro, OR, USA | ||
| SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Software INCA Suite 4.14 V | Oxford Instruments, Ableton, UK | ||
| Solarix 7T | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Syringe pump | kdScientific, MA, USA | 78-9100K | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 302031 | |
| X-Max spectrometer | Oxford Instruments, Ableton, UK |
References
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Heeren, R. M. A. MALDITechniques in Mass Spectrometry Imaging. Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry. , (2017).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andrén, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Zaima, N., Hayasaka, T., Goto-Inoue, N., Setou, M. Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 5040-5055 (2010).
- Qin, L., et al. Recent advances in matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry imaging (MALDI-MSI) for in Situ analysis of endogenous molecules in plants. Phytochemical Analysis. 29 (4), 351-364 (2018).
- Bhandari, D. R., et al. High resolution mass spectrometry imaging of plant tissues: Towards a plant metabolite atlas. Analyst. 140 (22), 7696-7709 (2015).
- Boughton, B. A., Thinagaran, D., Sarabia, D., Bacic, A., Roessner, U. Mass spectrometry imaging for plant biology: a review. Phytochemistry Reviews. 15 (3), 445-488 (2016).
- Dong, Y., et al. Sample preparation for mass spectrometry imaging of plant tissues: a review. Frontiers in Plant Science. 7, 60 (2016).
- Zhang, Y. X., Zhang, Y., Shi, Y. P. A reliable and effective sample preparation protocol of MALDI-TOF-MSI for lipids imaging analysis in hard and dry cereals. Food Chemistry. 398, 133911 (2023).
- Brum, F. L., Martins, G. R., Mohana-Borges, R., da Silva, A. S. The acquisition of thin sections of açaí (Euterpe oleracea Mart.) seed with elevated potassium content for molecular mapping by mass spectrometry imaging. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , e9474 (2023).
- Martins, G. R., et al. Chemical characterization, antioxidant and antimicrobial activities of açaí seed (Euterpe oleracea Mart.) extracts containing A- and B-type procyanidins. LWT. 132, 109830 (2020).
- Martins, G. R., et al. Phenolic profile and antioxidant properties in extracts of developing açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 70 (51), 16218-16228 (2022).
- Jorge, F. T. A., Silva, A. S. A., Brigagão, G. V. Açaí waste valorization via mannose and polyphenols production: techno-economic and environmental assessment. Biomass Conversion and Biorefinery. , (2022).
- Carvalho, L. M. J., Esmerino, A. A., Carvalho, J. L. V. Jussaí (Euterpe edulis): a review. Food Science and Technology. 42, (2022).
- Yamaguchi, K. K. d. L., Pereira, L. F. R., Lamarão, C. V., Lima, E. S., Veiga-Junior, V. F. d. Amazon acai: chemistry and biological activities: A Review. Food Chemistry. 179, 137-151 (2015).
- Wu, R., et al. Copper adhesive tape attached to the reverse side of a non-conductive glass slide to achieve protein MALDI-imaging in FFPE-tissue sections. Chemical Communications. 57 (82), 10707-10710 (2021).
- Dufresne, M., Patterson, N. H., Norris, J. L., Caprioli, R. M. Combining salt doping and matrix sublimation for high spatial resolution MALDI imaging mass spectrometry of neutral lipids. Analytical Chemistry. 91 (20), 12928-12934 (2019).
- Aguiar, M. O., de Mendonça, M. S. Morfo-anatomia da semente de Euterpe precatoria Mart (Palmae). Revista Brasileira de Sementes. 25, 37-42 (2003).
- Panza, V., Láinez, V., Maldonado, S. Seed structure and histochemistry in the palm Euterpe edulis. Botanical Journal of the Linnean Society. 145 (4), 445-453 (2004).
- Alves, V. M., et al. Provenient residues from industrial processing of açaí berries (Euterpe precatoria Mart): nutritional and antinutritional contents, phenolic profile, and pigments. Food Science and Technology. 42, (2022).
- Inada, K. O. P., et al. Screening of the chemical composition and occurring antioxidants in jabuticaba (Myrciaria jaboticaba) and jussara (Euterpe edulis) fruits and their fractions. Journal of FunctionalFoods. 17, 422-433 (2015).
- Monteiro, A. F., Miguez, I. S., Silva, J. P. R. B., Silva, A. S. High concentration and yield production of mannose from açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds via mannanase-catalyzed hydrolysis. Scientific Reports. 9 (1), 10939 (2019).
