Göz Merceğinin Korteks ve Çekirdeğinden Demetlerin ve Tek Fiber Hücrelerin Hazırlanması ve İmmünofloresan Boyanması
Summary
Bu protokol, karmaşık hücreden hücreye interdigitasyonları ve membran mimarisini incelemek için periferik, olgun ve nükleer göz merceği fiber hücrelerini immünofloresan boyama için hazırlama yöntemlerini açıklar.
Abstract
Lens, gözün ön kamarasında bulunan ve net bir görüntü oluşturmak için ışığı retinaya ince bir şekilde odaklamak için şekil değiştiren şeffaf ve elipsoid bir organdır. Bu dokunun büyük kısmı, altıgen bir kesite sahip olan ve lensin ön kutuplarından arka kutuplarına kadar uzanan özel, farklılaşmış lif hücrelerinden oluşur. Bu uzun ve sıska hücreler, komşu hücrelere sıkı sıkıya karşıdır ve hücrenin uzunluğu boyunca karmaşık iç içe geçmelere sahiptir. Özel birbirine kenetlenme yapıları, lensin normal biyomekanik özellikleri için gereklidir ve elektron mikroskobu teknikleri kullanılarak kapsamlı bir şekilde tanımlanmıştır. Bu protokol, bu karmaşık şekilli hücreler içindeki proteinlerin ayrıntılı lokalizasyonuna izin vermek için tekil ve fare lens lifi hücrelerinin demetlerini korumak ve immün boyamak için ilk yöntemi gösterir. Temsili veriler, merceğin tüm bölgelerinde periferik, farklılaşan, olgun ve nükleer fiber hücrelerin boyandığını gösterir. Bu yöntem potansiyel olarak diğer türlerin lenslerinden izole edilen lif hücrelerinde kullanılabilir.
Introduction
Lens, gözün ön kamarasında epitelyal ve lif hücreleri 1 olmak üzere iki hücre tipinden oluşan şeffaf ve oval bir dokudur (Şekil 1). Lensin ön hemisferini kaplayan tek bir epitel hücresi tabakası vardır. Fiber hücreler epitel hücrelerinden ayrılır ve lensin büyük kısmını oluşturur. Son derece özelleşmiş lif hücreleri, lens çevresinden lens merkezinekadar hücre zarı morfolojisinde belirgin değişikliklerle işaretlenmiş bir uzama, farklılaşma ve olgunlaşma programlamasına tabi tutulur 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , lens çekirdeği olarak da bilinir. Merceğin retinaya çeşitli mesafelerden gelen ışığı ince odaklama işlevi, sertlik ve elastikiyetdahil olmak üzere biyomekanik özelliklerine bağlıdır 13,14,15,16,17,18,19. Lens liflerinin karmaşık interdigitasyonları20,21 olarak varsayılmıştır ve yakın zamanda lens sertliği22,23 için önemli olduğu gösterilmiştir.
Şekil 1: Lens anatomi diyagramları ve lens liflerinden temsili taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri. Karikatür, epitel hücrelerinin ön tek tabakasının (açık mavi gölgeli) uzunlamasına (yukarıdan aşağıya) ve lens lifi hücrelerinin (beyaz) toplu bir kütlesini göstermektedir. Merceğin merkezi (pembe gölgeli) çekirdek olarak bilinir ve oldukça sıkıştırılmış fiber hücrelerden oluşur. Sağ tarafta, enine kesitli bir karikatür, bal peteği deseninde paketlenmiş lens liflerinin uzatılmış altıgen hücre şeklini ortaya koyuyor. Fiber hücrelerin iki geniş kenarı ve dört kısa kenarı vardır. Alt kısımdaki temsili SEM görüntüleri, lensin farklı derinliklerindeki lens fiber hücreleri arasındaki karmaşık membran geçişlerini gösterir. Sağdan, lens çevresinde yeni oluşan lens fiberlerinin kısa kenarları boyunca küçük çıkıntıları ve geniş kenarı boyunca bilyeler ve yuvalar vardır (kırmızı kutular). Olgunlaşma sırasında, lens lifleri, kısa kenarlar (mavi kutular) boyunca küçük çıkıntılarla süslenmiş büyük kürek alanları geliştirir. Olgun lif hücreleri, küçük çıkıntılarla gösterilen büyük kürek alanlarına sahiptir. Bu birbirine kenetlenen alanlar, lensin biyomekanik özellikleri için önemlidir. Mercek çekirdeğindeki lif hücreleri, kısa kenarları boyunca daha az küçük çıkıntıya sahiptir ve karmaşık dil ve oluk aralarına (mor kutular) sahiptir. Hücrenin geniş kenarları küresel bir zar morfolojisi gösterir. Karikatür22,32’den değiştirildi ve ölçeğe göre çizilmedi. Ölçek çubuğu = 3 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Lens, önceki nesil liflerin üzerine bindirilmiş yeni lif hücrelerinin kabukları eklenerek büyür24,25. Fiber hücreler, iki geniş kenarı ve dört kısa kenarı olan uzun, altıgen bir kesit şekline sahiptir. Bu hücreler merceğin ön kutbundan arka kutbuna kadar uzanır ve türe bağlı olarak mercek liflerinin uzunluğu birkaç milimetre olabilir. Bu uzun ve ince hücrelerin yapısını desteklemek için, geniş ve kısa kenarlar boyunca özel interdigitasyonlar, lens şeklini ve biyomekanik özellikleri korumak için birbirine kenetlenen yapılar oluşturur. Fiber hücre farklılaşması ve olgunlaşması sırasında hücre zarı şeklindeki değişiklikler, elektron mikroskobu (EM) çalışmalarıile kapsamlı bir şekilde belgelenmiştir 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Yeni oluşan lif hücreleri, kısa kenarları boyunca çok küçük çıkıntılar ile geniş kenarları boyunca bilyeler ve yuvalara sahipken, olgun liflerin kısa kenarları boyunca birbirine kenetlenen çıkıntılar ve kürekler bulunur. Nükleer lifler, dil ve oluk arası sayısallıklar ve küresel zar morfolojisi gösterir. Bu karmaşık birbirine kenetlenen zarlar için gerekli olan proteinler hakkında çok az şey bilinmektedir. Fiber hücrelerde protein lokalizasyonu üzerine yapılan önceki çalışmalar, karmaşık hücre mimarisinin net bir şekilde görüntülenmesine izin vermeyen lens dokusu kesitlerine dayanıyordu.
Bu çalışma, karmaşık morfolojiyi korumak ve hücre zarındaki ve sitoplazmadaki proteinler için immün boyamaya izin vermek için tek ve demet lens lifi hücrelerini sabitlemek için yeni bir yöntem yarattı ve mükemmelleştirdi. Bu yöntem, EM çalışmalarından elde edilen verilerle karşılaştırılabilir hücre zarı mimarisini aslına uygun olarak korur ve spesifik proteinler için birincil antikorlarla boyamaya izin verir. Daha önce farklılaşma ve olgunlaşma geçiren immün kortikal lens lifleri vardı22,23. Bu protokolde, lens çekirdeğinden lif hücrelerini boyamak için yeni bir yöntem de vardır. Bu protokol, fiber hücre olgunlaşması ve lens çekirdeği sıkıştırması sırasında membran interdigitasyonlarındaki oluşum ve değişikliklerin mekanizmalarını anlamak için kapıyı açar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, lensin çeşitli derinliklerinden demetlerin veya tekil lens fiber hücrelerinin 3D membran morfolojisini aslına uygun olarak koruyan fiksasyon, koruma ve immün boyama yöntemlerini göstermiştir. Lekeli lens lifleri, lens lifi hücre morfolojisini incelemek için uzun süredir kullanılan SEM preparatları ile karşılaştırılır. Sonuçlar, her iki preparat arasında karşılaştırılabilir membran yapılarını göstermektedir. EM, hücre morfolojisini incelemek için altın standart olmaya devam et…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Göz Enstitüsü’nden R01 EY032056 (CC’ye) hibesi ile desteklenmiştir. Yazarlar, elektron mikroskobu görüntülerine yardımları için Scripps Araştırma Çekirdek Mikroskopi Tesisi’nden Dr. Theresa Fassel ve Kimberly Vanderpool’a teşekkür eder.
Materials
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
References
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. 发育生物学. 280 (1), 1-14 (2005).
- Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).
- Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).
- Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens. Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).
- Lo, W. K., Harding, C. V. Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers. Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).
- Taylor, V. L., et al. Morphology of the normal human lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (7), 1396-1410 (1996).
- Vrensen, G. F. Aging of the human eye lens-a morphological point of view. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).
- Vrensen, G. F., Duindam, H. J. Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations. Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation. Albrecht von Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).
- Zhou, C. J., Lo, W. K. Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells. Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).
- Kuwabara, T. The maturation of the lens cell: a morphologic study. Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).
- Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G. Stiffness gradient in the crystalline lens. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (9), 1357-1366 (2007).
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).
- Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
- Lo, W. K., et al. Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).
- Cheng, C., et al. Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties. Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Kuszak, J. R. The development of lens sutures. Progress in Retinal and Eye Research. 14 (2), 567-591 (1995).
- Bassnett, S., Costello, M. J. The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens. Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).
- Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice. Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).
- Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2 (2022).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. Journal of Visualized Experiments. (111), e53986 (2016).
- Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E., Saunders, W. B. Anatomy of the eye and orbit. The Eye (Fourth Edition). , 1 (2016).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labeling for scanning electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Goldberg, M. W. High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex. Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).
- Hermann, R., Walther, P., Muller, M. Immunogold labeling in scanning electron microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
