Här beskriver vi metoder för mikrofabrikation av vertikalt inriktade kolnanofibrer (VACNF), överföring av VACNF till flexibla substrat och applicering av VACNF på både styva och flexibla substrat till växter för leverans av biomolekyler och färgämnen.
Att leverera biomolekyler och ogenomträngliga färgämnen till intakta växter är en stor utmaning. Nanomaterial är nya verktyg för leverans av DNA till växter. Även om dessa nya verktyg är spännande har de ännu inte tillämpats i stor utsträckning. Nanomaterial som tillverkas på styvt substrat (underlag) är särskilt svåra att framgångsrikt tillämpa på krökta växtstrukturer. Denna studie beskriver processen för mikrotillverkning av vertikalt inriktade kolnanofibermatriser och överföring av dem från ett styvt till ett flexibelt substrat. Vi beskriver och demonstrerar hur dessa fibrer (på antingen styva eller flexibla substrat) kan användas för transient transformation eller färgämnesleverans (t.ex. fluorescein) till växter. Vi visar hur VACNF:er kan överföras från ett styvt kiselsubstrat till ett flexibelt SU-8 epoxisubstrat för att bilda flexibla VACNF-arrayer. För att övervinna SU-8:s hydrofoba natur belades fibrerna i den flexibla filmen med ett tunt kiseloxidskikt (2-3 nm). För att använda dessa fibrer för leverans till böjda växtorgan deponerar vi en 1 μL droppe färgämne eller DNA-lösning på fibersidan av VACNF-filmer, väntar 10 min, placerar filmerna på växtorganet och använder en pinne med en rullande rörelse för att driva fibrer in i växtceller. Med denna metod har vi uppnått färg- och DNA-leverans i växtorgan med krökta ytor.
Växtomvandling (både övergående och stabil) har ännu inte blivit allmänt uppnåelig i alla växtvävnader och arter. Den transienta omvandlingen av växter är en process genom vilken gener som kodas i plasmider tillfälligt förs in i växter men inte inkorporeras stabilt i genomet. Traditionella metoder som använder partikelbombardemang, agrobakterier, elektroporering eller polyetylenglykolbehandling av protoplaster är långsamma eller kan vara besvärliga. Dessutom är de inte tillämpliga på alla växtarter 1,2,3,4. Användningen av nanomaterial för DNA-leverans är ett växande område som fortfarande är i sin linda5. Nanomaterial, särskilt kolnanofibrer, har också framgångsrikt använts för att leverera proteiner, dextraner och färgämnen till växtblad utan att orsaka sårrespons6. Målet med detta arbete är att tillhandahålla ett detaljerat protokoll för att använda en typ av nanomaterial, kolnanofibrer, för att leverera biomolekyler eller färgämnen till växter. Här fokuserar vi på DNA som den biomolekyl som valts, vilket möjliggör transient transformation av celler i olika växtorgan.
Tidigare har Morgan et al.7 demonstrerat användningen av kolnanofibrer fästa på styvt kiselsubstrat för att tillfälligt omvandla blad av sallad, N. benthamiana och poppel, och både blad och rötter av Arabidopsis. Även om omvandlingar var framgångsrika på en mängd olika organ, var fibrer svårare att applicera på växtvävnader med krökta ytor, såsom rötter eller frukter. Vi resonerade att en flexibel bärare för nanofibrer skulle kunna förbättra deras effektivitet genom att bättre anpassa sig till organets form.
Här beskriver vi metoder som används för att tillverka och designa vertikalt inriktade kolnanofibrer, överföra VACNF:er till flexibla substrat och applicera VACNF:er på både styva och flexibla substrat till växter för att leverera biomolekyler och färgämnen. Kolnanofibrer producerades med hjälp av likströmskatalytisk plasmaförstärkt kemisk ångdeponering (dc C-PECVD) med Ni-katalysator. Positionen, diametern och höjden på Ni-katalysatorprickarna kontrollerades med hjälp av en kombination av elektronstrålelitografi, metallavdunstning och lyftprocesser som beskrivs av Melechko et al.8,9. Med hjälp av ett dubbelskikts e-strålmotstånd kan en tjockare Ni-katalysator deponeras på substratet för att ge längre fibrer10. Fiberöverföring från ett styvt till ett flexibelt substrat är baserat på en modifiering av metoder som beskrivs i Fletcher et al.11, där de nuvarande metoderna avstår från användning av ett amorft kolskikt eller ett offerfotoresistskikt. SU-8 lyft med fiberöverföring uppnås genom att utnyttja den inneboende dragspänningen till följd av underbakning och underexponering av SU-812,13,14. SU-8, en komplex polymer, är naturligt hydrofob, vilket gör det svårt att använda den för att underlätta DNA-leverans. För att motverka SU-8:s hydrofoba natur applicerar vi ett tunt lager kiseloxid via atomlagerdeponering15 efter att fibrerna bäddats in i SU-8. Applicering av fibrer på ett styvt substrat för leverans av biomolekyler/färgämnen utnyttjar slagkraften från pincetttappning som beskrivs i Davern et al.6 och de metoder på växt och på chip som beskrivs i Morgan et al.7. Flexibla VACNF-filmer appliceras på böjda växtytor genom att först halvtorka DNA eller färgdroppar på filmen som med on-chip-metoden från Morgan et al.7och sedan rulla filmerna på böjda växtytor med hjälp av en liten sminkapplikator16,17. Figur 1 visar olika tillvägagångssätt för applicering av fibrer i styva och flexibla substrat på växter.
I den här artikeln presenterade vi metoder för att konstruera vertikalt inriktade kolnanofibermatriser, överföra fibrerna till ett flexibelt substrat och applicera fibrer i antingen ett styvt eller flexibelt substrat på växter för användning vid leverans av biomolekyler eller färgämnen till växter. Vi beskrev två generella tillvägagångssätt, on-chip och on-plant metoder, för deponering av de introducerade materialen och visade framgångsrika resultat i fibrer på ett styvt substrat samt on-chip-metoden med VACNF-filmer. Tillämpningen av dessa fibrer är enklare i praktik och teori än traditionella växtomvandlingsmetoder (partikelbombardemang, protoplastomvandling via PEG eller elektroporering) och kan användas för växter som är motsträviga mot Agrobacterium-medierad transformation. Det är dock bara ett fåtal celler som omvandlas.
Vertikalt inriktade kolnanofibrer producerades vid Oak Ridge National Laboratory Center for Nanophase Materials Sciences genom deras användarprogram. Användare kan ansöka om att använda denna anläggning för produktion av VACNF:er. Alternativt kan VACNF-chips produceras i renrum med likströmsplasmaförstärkta kemiska ångavsättningsmaskiner med en kolkälla22,23. Med de beskrivna metoderna finns det några steg som är avgörande för produktionen av fibrerna, fiberöverföringen och appliceringen av VACNF-chipsen/filmerna. För att fiberapplicering ska fungera måste fibrerna vara raka och ha en avsmalnande diameter på <200 nm vid spetsen för att leverans i växtceller ska lyckas 6,7 (figur 3). För att skapa kolnanofibrer av en viss storlek och tonhöjd finns det en mängd olika parametrar som kan ändras, inklusive punktstorlek, lateral stigning och mängden katalysator som deponeras. För att välja den optimala punktstorleken som ska användas för kolnanofiberproduktionen odlades fibrer från olika punktstorlekar (som visas i figur 5). Vi fann att 300 nm i diameter gav de bästa fibrerna, därför valdes denna punktstorlek (figur 5). Efter att ha hittat rätt parametrar tittade vi på att använda chips som har >50 % fibrer med den idealiska geometrin (rak och en spetsdiameter <200 nm). För att kontrollera fibrernas geometri använde vi svepelektronmikroskopi för att avbilda slumpmässiga synfält på ett prov av VACNF-chips/filmer.
Dessutom måste fibrerna ha en viss minimilängd för att uppnå leverans i växtceller. Vikten av att producera fibrer av olika längd är att längre fibrer kan användas för att tränga in i djupare vävnadslager. Längre fibrer (>40 μm långa) är viktiga för flexibla filmer eftersom fiberöverföringen fungerar genom att bryta fibrerna från basen och kräver att SU-8 läggs ovanpå fibrerna. Arbetstjockleken på SU-8-skiktet som används för detta protokoll är 20-35 μm. Den minsta höjd som krävs för att åstadkomma leverans i epidermis av olika växter (böjda eller platta) är 10-15 μm 6,7. Som ett resultat är fibrer med längder >40 μm nödvändiga för VACNF-filmer. Det finns flera olika parametrar att ta hänsyn till vid tillverkning av kolnanofibrer: katalysatormaterial, katalysatorgeometri, tjocklek på katalysatormaterial samt förhållanden i PECVD-kammaren (gasförhållande, tryck, temperatur, ström, duschmunstyckets höjd och tillväxttid)8,9,24,25. För att producera kolnanofibrer längre än 25 μm som används av Morgan et al.7 och Davern et al.6, ökade vi mängden Ni-katalysator, ändrade förhållandet mellan acetylen och ammoniak och ökade strömmen och tillväxttiden. Dessutom ägnade vi mer uppmärksamhet åt katalysatormaterialets geometri. För att producera höga raka fibrer behövde den deponerade katalysatorn ha en hockeypuckform snarare än en form som liknar en vulkan (figur 4). Vulkanstrukturer uppstår från rester av fotoresist efter start. För att förhindra bildandet av vulkaner användes ett dubbelt lager av PMMA för att skapa en underskärning under elektronstrålelitografi26. Underskärningen hjälper till att lyfta av den avsatta metallkatalysatorn (figur 2). Katalysatorns tjocka skikt är viktigt för tillväxten av höga VACNF:er. Morfologin hos VACNF:erna har undersökts av Merkulova et al.24. Den vertikala inriktningen av VACNF:er beror på både tillväxten av Ni-katalysatorspetsens typ och inriktningen av DC-potentialen vinkelrätt mot substratet (figur 6). Duschhuvudet beskriver geometrin hos PECVD-reaktorn (figur 6) och fungerar som källa för potentialen för det elektriska fältet27.
För att definiera matrisen av katalysatorprickar med elektronstrålelitografi applicerade vi ett elektronstrålemotstånd (polymetylmetakrylat) och använde sedan e-strålen för att göra små hål i resisten med en specifik form och på specifika platser på skivan. Hål med önskad diameter placerades på ett vanligt rutnät med det definierade avståndet (stigning) och en fil som specificerade det önskade mönstret laddades in i elektronstrålelitografiverktyget innan substratet laddades in i maskinen. Förutom fiberhöjden är en annan kritisk parameter för framgångsrik fiberöverföring den tid som spenderas i acetonbadet. VACNF-filmerna måste lämnas i acetonbadet tillräckligt länge för att deras kanter ska börja krulla; Om de lämnas i acetonbadet för kort tid är de svårare att lyfta bort från chipsen och kan gå sönder. Ju äldre chipsen är, desto längre måste de ligga kvar i acetonbadet. Efter acetonbadet placerades filmerna/chipsen i isopropanol och vatten för att avlägsna aceton samt för att ta bort den skyddande fotoresisten på fibrerna.
För att utföra spinnbeläggning placeras wafers eller waferbitar på en vakuumchuck i spinncoatern, och skivans centrala position verifieras med hjälp av spinnbestrykarens testfunktion. En liten pöl (~2.5 cm i diameter) av resist appliceras på mitten av skivan och snurras (3000 rpm i 45 s) Bilder av fibrerna före och efter spinnbeläggning ingår i figur 8 som visar bevarandet av fibergeometri (höjd, orientering och stigning). Närvaron av fibrer gör att resist väller upp vid basen av fibrerna och resulterar i tjockare lager än förväntat. Spin-beläggning efter VACNF-tillväxt har undersökts av andra grupper11,18.
Ett annat steg i processen som är av avgörande betydelse är att se till att rätt mängd kraft appliceras på VACNF-chips/filmer. Leveransmekanismen är beroende av att fibrerna gör små punkteringar i cellväggarna via pincettens impulskraft, knackar på styva substrat 6,7 eller rullar med mini-makeup-applikatorn på flexibla substrat. Fibrer kan brytas av och förbli inbäddade i växtceller6,7 utan att det påverkar resultatet, men övning i samband med undersökning av färgupptag och vävnadsskador är nödvändig för att få rätt tryck. Dessutom är det viktigt att välja lämpliga avbildningstidpunkter efter DNA-leverans med VACNF-chips/filmer eftersom tiden till detekterbart uttryck varierar mellan växtarter och de typer av vektorer som levereras7 (figur 16).
Även om denna metod är allmänt tillämplig på växter har den några begränsningar. Att till exempel lägga till ett tunt lager kiseloxid till VACNF-filmerna resulterar inte alltid i att filmerna blir helt hydrofila på grund av det skyddande skiktet av fotoresist som läggs ovanpå SU-8. Om detta problem uppstår kan tjockare lager av kiseloxid appliceras på VACNF:er. För att testa om filmerna är hydrofoba eller hydrofila kan de placeras i vatten. Om filmerna sjunker är de hydrofila, och om de flyter är de hydrofoba. Dessutom kan det finnas variation mellan partier av fibrer som produceras. Det finns flera parametrar som kan ändras när fibrerna odlas i dc-PECVD-maskinen; det som beskrivs i detta protokoll är en uppsättning parametrar för två olika mängder Ni-katalysator. Dessutom kan kristallorienteringen av Ni-katalysatorn inte kontrolleras28 och viss förgrening kommer oundvikligen att resultera i fibrerna.
Även om vi demonstrerade leveransen av fluoresceinfärgämne och DNA till växtceller med hjälp av både styva och flexibla substrat för denna artikel, bör metoden vara allmänt tillämplig för andra biomolekyler och genetiska modifieringsmetoder, till exempel RNAi-avstängning för växtsystem som äpplen eller andra frukter där det skulle ta år att producera stabila transgena linjer. Dessutom kan dessa fibrer också användas för att leverera genetiska redigeringsmaterial eller för stabila transformationer i växter.
The authors have nothing to disclose.
Nanofibermatriser tillverkades vid Center for Nanophase Materials Sciences, som är en Department of Energy Office of Science User Facility (Proposal ID: CNMS2019-103 och CNMS2022-A-1182). Stöd från CNMS beviljas genom ett expertgranskat förslagssystem och tillhandahålls utan kostnad till framgångsrika sökande som avser att publicera sina resultat (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). Vi tackar Kevin Lester och CNMS för hjälp med produktionen av nanofiberarrayer. Vi tackar Dr. John Caughmen, Dr. Timothy McKnight, Dr. Amber Webb, Daryl Briggs och Travis Bee för kritiska diskussioner om experimentell design. Vi tackar Dr. Adam Rondinone för schemat av PECVD-maskinen. Vi tackar Leslie Carol för de vetenskapliga illustrationerna. Detta arbete finansierades av Bioimaging Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, DE-SC0019104 och United States Department of Agriculture, 2021-67013-34835. JMM stöddes av United States Department of Agriculture: National Institute of Food and Agriculture: Agriculture and Food Research Initiative Predoctoral Fellowship 2021-67034-35167.
13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct | Fastenal | 690535 | |
2-Propanol (IPA) | Fischer Scientific | A451-4 | |
4" Lid | Entegris | H22-401-0615 | Wafer Carriers |
4" tray | Entegris | H22-40-0615 | Wafer Carriers |
Accretech SS10 dicing saw | Accreteck | SS10 | |
Acetone | Fischer Scientific | A18-4 | |
Acetone used in the cleanroom at ORNL | JT Baker | 9005-05 | |
Apples | Grocery store | No product number | |
Arabidopsis thaliana | Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago | No product number | |
Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine | Oak Ridge National Laboratory | Custom-built | |
Cobham Green lettuce | Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis | No product number | Butterhead lettuce |
Fluorescein dye | Sigma Aldrich | F2456-2.5G | |
Gel-box | Gel-Pak | AD-23C-00-X4 | |
Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool | Heidelberg | DWL 66 | |
ImageJ | National Institues of Health | No product number | |
Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL | Doe and Ingalls | CMOS Grade 9079-05 | |
JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system | JEOL | 8100 | |
Kimwipes | Kimtech | Kimberly-Clark Professional 34120 | |
Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish | VWR | 11019-554 | |
Layout Editor | juspertor GmbH | No product number | |
LSM 710 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
LSM 800 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
Make-up applicator | Amazon | G2PLUS | 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS |
Merlin field emission scanning electron microscope | Zeiss | Merlin | |
MIBK/IPA (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) | Microchem | M089025 | |
Onions | Grocery store | No product number | |
Oxford FlexAl atomic layer deposition | Oxford | FlexAl | |
PMMA 495 A4 | Microchem | M130004 | |
PMMA 950 A4 | Microchem | M230004 | Can dilute down to A2 |
Polyethylene terephthalate (PET) | Amazon | KS-6304-21-11 | Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc |
Precision tweezers | Aven Inc. | 18032TT | |
pUBQ10:YFP-GW | Arabidopsis Biological Resource Center | CD3-1948 | |
Silicon etcher (used for descum) | Oxford | Plasmalab | |
Silicon rubber kit | Smooth-On Inc | Ecoflex 00-20 | |
Silicon wafers | Pure Wafer | 4N0.001-.005SSP-INV | |
Spin coater | Brewer Sciences | Model 100CB | |
SPR 955cm 0.7 | Megaposit | 10018314 | |
Strawberries | Grocery store | No product number | |
SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 Series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
SU-8 developer | Microchem | SU-8 2000 Series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
Suss MicroTec contact aligner | Suss MicroTec | MA6/BA6 | |
Table top microscope | Phenom XL | used for checking Ni catalysts after metal deposition | |
Thermionics VE-240 e-beam evaporator | Thermionics | VE-240 |