Her beskriver vi metoder for mikrofabrikasjon av vertikalt justerte karbonnanofibre (VACNF), overføring av VACNFer til fleksible substrater og påføring av VACNFer på både stive og fleksible underlag til planter for biomolekyl og fargestofflevering.
Levering av biomolekyler og ugjennomtrengelige fargestoffer til intakte planter er en stor utfordring. Nanomaterialer er up-and-coming verktøy for levering av DNA til planter. Så spennende som disse nye verktøyene er, har de ennå ikke blitt mye brukt. Nanomaterialer produsert på stivt substrat (backing) er spesielt vanskelig å lykkes med å anvende på buede plantestrukturer. Denne studien beskriver prosessen for mikrofabrikasjon vertikalt justerte karbon nanofiber arrays og overføre dem fra et stivt til et fleksibelt substrat. Vi detaljerer og demonstrerer hvordan disse fibrene (på enten stive eller fleksible substrater) kan brukes til forbigående transformasjon eller fargestoff (f.eks. fluorescein) levering til planter. Vi viser hvordan VACNF-er kan overføres fra stivt silisiumsubstrat til et fleksibelt SU-8 epoksysubstrat for å danne fleksible VACNF-arrayer. For å overvinne den hydrofobe naturen til SU-8 ble fibre i den fleksible filmen belagt med et tynt silisiumoksydlag (2-3 nm). For å bruke disse fibrene til levering til buede planteorganer, deponerer vi en 1 μL dråpe fargestoff eller DNA-løsning på fibersiden av VACNF-filmer, venter 10 minutter, plasserer filmene på planteorganet og bruker en vattpinne med en rullende bevegelse for å drive fibre inn i planteceller. Med denne metoden har vi oppnådd fargestoff og DNA-levering i planteorganer med buede overflater.
Plantetransformasjon (både forbigående og stabil) har ennå ikke blitt allment oppnåelig i alle plantevev og arter. Den forbigående transformasjonen av planter er en prosess der gener kodet i plasmider midlertidig blir introdusert i planter, men er ikke stabilt innlemmet i genomet. Tradisjonelle metoder som bruker partikkelbombardement, agrobakterier, elektroporering eller polyetylenglykolbehandling av protoplaster er langsom eller kan være tungvint. Videre er de ikke anvendelige for alle plantearter 1,2,3,4. Bruk av nanomaterialer til DNA-levering er et spirende felt som fortsatt er i sin spede begynnelse5. Nanomaterialer, spesielt karbonnanofibre, har også blitt brukt til å levere proteiner, dextrans og fargestoffer til planteblader uten å forårsake sårrespons6. Målet med dette arbeidet er å gi en detaljert protokoll for bruk av en type nanomateriale, karbonnanofibre, for levering av biomolekyler eller fargestoffer til planter. Her fokuserer vi på DNA som det valgte biomolekylet, som tillater forbigående transformasjon av celler i forskjellige planteorganer.
Tidligere demonstrerte Morgan et al.7 bruken av karbonnanofibre festet til stivt silisiumsubstrat for forbigående å transformere blader av salat, N. benthamiana og poppel, og både blader og røtter av Arabidopsis. Selv om transformasjoner var vellykkede på en rekke organer, var fibre vanskeligere å bruke på plantevev med buede overflater, som røtter eller frukt. Vi resonnerte at en fleksibel støtte for nanofibre kan forbedre leveringseffektiviteten ved å tilpasse seg organets form bedre.
Her beskriver vi metoder som brukes til å fremstille og designe vertikalt justerte karbonnanofibre, overføre VACNFer til fleksible substrater og påføre VACNFer på både stive og fleksible underlag til planter for å levere biomolekyler og fargestoffer. Karbonnanofibre ble produsert ved bruk av likestrøms katalytisk plasmaforsterket kjemisk dampavsetning (DC C-PECVD) med Ni-katalysator. Posisjonen, diameteren og høyden på Ni-katalysatorpunkter ble styrt ved hjelp av en kombinasjon av elektronstrålelitografi, metallfordampning og løfteprosesser som beskrevet av Melechko et al.8,9. Ved hjelp av en dobbeltlags e-strålemotstand kan en tykkere Ni-katalysator avsettes på underlaget for å gi lengre fibre10. Fiberoverføring fra et stivt til et fleksibelt substrat er basert på en modifikasjon av metoder beskrevet i Fletcher et al.11, med de nåværende metodene som forutsetter bruk av et amorft karbonlag eller et offerfotoresistlag. SU-8 lift-off med fiberoverføring oppnås ved å utnytte den iboende strekkspenningen som følge av underbaking og undereksponering av SU-812,13,14. SU-8, en kompleks polymer, er naturlig hydrofob, noe som gjør bruken for å lette DNA-levering vanskelig. For å motvirke den hydrofobe naturen til SU-8, påfører vi et tynt lag silisiumoksid via atomlagsavsetning15 etter at fibre er innebygd i SU-8. Påføring av fibre på et stivt substrat for levering av biomolekyl / fargestoff utnytter slagkraften til pinsetttapping beskrevet i Davern et al.6 og metodene på anlegget og på brikken beskrevet i Morgan et al.7. Fleksible VACNF-filmer påføres buede planteoverflater ved først å halvtørke DNA eller fargestoffdråper på filmen som med on-chip-metoden fra Morgan et al.7og deretter rulle filmene på buede planteflater ved hjelp av en liten sminkeapplikator16,17. Figur 1 viser ulike tilnærminger for å påføre fibre i stive og fleksible substrater på planter.
I dette papiret presenterte vi metoder for å konstruere vertikalt justerte karbonnanofiberarrayer, overføre fibrene til et fleksibelt substrat og påføre fibre i enten et stivt eller fleksibelt substrat til planter for bruk i levering av biomolekyler eller fargestoffer til planter. Vi beskrev to generelle tilnærminger, on-chip og on-plant metoder, for deponering av de introduserte materialene og viste vellykkede resultater i fibre på et stivt substrat samt on-chip-metoden ved bruk av VACNF-filmer. Anvendelsen av disse fibrene er enklere i praksis og teori enn tradisjonelle plantetransformasjonsmetoder (partikkelbombardement, protoplasttransformasjon via PEG eller elektroporering) og kan brukes til planter som er gjenstridige mot Agrobacterium-mediert transformasjon. Imidlertid blir bare noen få celler transformert.
Vertikalt justerte karbonnanofibre ble produsert ved Oak Ridge National Laboratory Center for Nanophase Materials Sciences gjennom deres brukerprogram. Brukere kan søke om å bruke dette anlegget for produksjon av VACNFer. Alternativt kan VACNF-brikker produseres i rene rom med likestrømsforsterkede kjemiske dampavsetningsmaskiner med en karbonkilde22,23. Med metodene som er beskrevet, er det noen få trinn som er kritiske for produksjonen av fibrene, fiberoverføringen og anvendelsen av VACNF-brikkene/filmene. For at fiberapplikasjonen skal fungere, må fibrene være rette og ha en avsmalnende diameter på <200 nm på spissen for levering i planteceller for å lykkes 6,7 (figur 3). For å lage karbonnanofibre av spesiell størrelse og tonehøyde, er det en rekke parametere som kan endres, inkludert punktstørrelse, sidehøyde og mengden katalysator som er avsatt. For å velge den optimale punktstørrelsen som skal brukes til karbonnanofiberproduksjonen, ble fibre dyrket fra forskjellige punktstørrelser (som vist i figur 5). Vi fant at 300 nm diametere produserte de beste fibrene, derfor ble denne punktstørrelsen valgt (figur 5). Etter å ha funnet de riktige parametrene, så vi etter å bruke sjetonger som har >50% fibre med den ideelle geometrien (rett og en spissdiameter <200 nm). For å sjekke geometrien til fibrene brukte vi skanning elektronmikroskopi for å avbilde tilfeldige synsfelt på en prøve av VACNF-brikker / filmer.
I tillegg må fibrene ha en viss minimumslengde for å oppnå levering i planteceller. Betydningen av å produsere fibre av forskjellig lengde er at lengre fibre kan brukes til å trenge inn i dypere vevslag. Lengre fibre (>40 μm i lengde) er avgjørende for fleksible filmer, da fiberoverføringen fungerer ved å bryte fibrene fra basen og krever lagdeling av SU-8 på toppen av fibrene. Arbeidstykkelsen til SU-8-laget som brukes til denne protokollen er 20-35 μm. Minimumshøyden som er nødvendig for å oppnå levering i epidermis av forskjellige planter (buet eller flatt) er 10-15 μm 6,7. Som et resultat er fibre med lengder >40 μm nødvendige for VACNF-filmer. Det er flere forskjellige parametere å vurdere når man produserer karbonnanofibre: katalysatormateriale, katalysatorgeometri, tykkelse av katalysatormateriale samt forhold i PECVD-kammeret (gassforhold, trykk, temperatur, strøm, dusjhodehøyde og veksttid) 8,9,24,25. For å produsere karbonnanofibre lengre enn 25 μm brukt av Morgan et al.7 og Davern et al.6, økte vi mengden Ni-katalysator, endret acetylen: ammoniakkforholdet og økte strømmen og veksttiden. I tillegg har vi lagt mer vekt på geometrien til katalysatormaterialet. For å produsere høye rette fibre måtte den avsatte katalysatoren ha en hockeypuckform i stedet for en form som ligner en vulkan (figur 4). Vulkanstrukturer oppstår fra rester av fotoresist etter oppskytning. For å forhindre dannelse av vulkaner ble et dobbeltlag av PMMA brukt til å lage et undersnitt under elektronstrålelitografi26. Underskjæringen hjelper til med å løfte den avsatte metallkatalysatoren (figur 2). Det tykke laget av katalysatoren er viktig for veksten av høye VACNFer. Morfologien til VACNFene har blitt undersøkt av Merkulova et al.24. Den vertikale justeringen av VACNFer skyldes både Ni-katalysatorspisstypeveksten og justeringene av DC-potensialet vinkelrett på substratet (figur 6). Dusjhodet beskriver geometrien til PECVD-reaktoren (figur 6) og fungerer som kilde for potensialet for det elektriske feltet27.
For å definere rekken av katalysatorpunkter med elektronstrålelitografi, brukte vi en elektronstrålemotstand (polymetylmetakrylat), og brukte deretter e-strålen til å lage små hull i motstanden med en bestemt form og på bestemte steder på waferen. Hull med ønsket diameter ble plassert på et vanlig rutenett med den definerte avstanden (tonehøyde) og en fil som spesifiserte ønsket mønster ble lastet inn i elektronstrålelitografiverktøyet før underlaget ble lastet inn i maskinen. I tillegg til fiberhøyde er en annen kritisk parameter for vellykket fiberoverføring mengden tid brukt i acetonbadet. VACNF-filmene må stå i acetonbadet lenge nok til at kantene begynner å krølle seg; Hvis de blir igjen i acetonbadet i for liten tid, er de vanskeligere å løfte av sjetongene og kan bryte. Jo eldre sjetongene er, desto lengre må de forbli i acetonbadet. Etter acetonbadet ble filmene/flisene plassert i isopropanol og vann for å fjerne tilgangsaceton samt å fjerne den beskyttende fotoresisten på fibrene.
For å utføre spinnbelegg plasseres wafere eller waferstykker på en vakuumchuck i spinnbelegget, og waferens sentrale posisjon verifiseres ved hjelp av testfunksjonen til spinnbeleggeren. En liten sølepytt (~ 2,5 cm i diameter) motstand påføres midten av waferen og spunnet (3000 o / min i 45 s) Bilder av fibrene før og etter spinnbelegg er inkludert i figur 8 som viser bevaring av fibergeometri (høyde, orientering og tonehøyde). Tilstedeværelsen av fibre forårsaker motstand mot godt opp ved foten av fibrene og resulterer i tykkere lag enn forventet. Spin-coating etter VACNF-vekst har blitt utforsket av andre grupper11,18.
Et annet trinn i prosessen som er av avgjørende betydning er å sikre at riktig mengde kraft påføres VACNF-brikker / filmer. Tilførselsmekanismen er avhengig av at fibre lager små punkteringer i cellevegger via impulskraften til pinsetten, banker på stive underlag 6,7 eller ruller med mini-sminkeapplikatoren på fleksible underlag. Fibre kan eller ikke kan bryte av og forbli innebygd i planteceller6,7 uten å påvirke utfallet, men praksis i forbindelse med undersøkelse for fargestoffopptak og vevskader er nødvendig for å få trykket riktig. I tillegg er det viktig å velge passende avbildningstidspunkter etter DNA-levering med VACNF-brikker/filmer, da tiden til detekterbart uttrykk varierer mellom plantearter og hvilke typer vektorer som leveres7 (figur 16).
Så bredt anvendelig som denne metoden er for planter, har den noen begrensninger. For eksempel vil tilsetning av et tynt lag silisiumoksid til VACNF-filmene ikke alltid resultere i at filmer blir helt hydrofile på grunn av det beskyttende laget av fotoresist lagt på toppen av SU-8. Hvis dette problemet oppstår, kan tykkere lag av silisiumoksid påføres VACNFer. For å teste om filmene er hydrofobe eller hydrofile, kan de plasseres i vann. Hvis filmene synker, er de hydrofile, og hvis de flyter, er de hydrofobe. I tillegg kan det være variasjon mellom partier av produserte fibre. Det er flere parametere som kan endres når fibrene vokser i dc -PECVD-maskinen; det som er beskrevet i denne protokollen er et sett med parametere for to forskjellige mengder Ni-katalysator. I tillegg kan krystallorienteringen til Ni-katalysatoren ikke kontrolleres28 , og noen forgrening vil uunngåelig resultere i fibrene.
Mens vi demonstrerte levering av fluoresceinfargestoff og DNA til planteceller ved hjelp av både stive og fleksible substrater for dette papiret, bør metoden være bredt anvendelig for andre biomolekyler og genetiske modifikasjonsmetoder, for eksempel RNAi-silencing for plantesystemer som epler eller andre frukter der det ville ta år å produsere stabile transgene linjer. Videre kan disse fibrene også brukes til å levere genetiske redigeringsmaterialer eller for stabile transformasjoner i planter.
The authors have nothing to disclose.
Nanofiberarrays ble produsert ved Center for Nanophase Materials Sciences, som er en Department of Energy Office of Science User Facility (Forslag ID: CNMS2019-103 og CNMS2022-A-1182). Støtte fra CNMS tildeles gjennom et fagfellevurdert forslagssystem og gis uten kostnad til vellykkede søkere som har til hensikt å publisere sine resultater (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). Vi takker Kevin Lester og CNMS for hjelp med produksjon av nanofiberarrays. Vi takker Dr. John Caughmen, Dr. Timothy McKnight, Dr. Amber Webb, Daryl Briggs og Travis Bee for kritiske diskusjoner om eksperimentell design. Vi takker Dr. Adam Rondinone for skjematisk av PECVD maskinen. Vi takker Leslie Carol for de vitenskapelige illustrasjonene. Dette arbeidet ble finansiert av Bioimaging Science Program, US Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, DE-SC0019104 og United States Department of Agriculture, 2021-67013-34835. JMM ble støttet av United States Department of Agriculture: National Institute of Food and Agriculture: Agriculture and Food Research Initiative Predoctoral Fellowship 2021-67034-35167.
13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct | Fastenal | 690535 | |
2-Propanol (IPA) | Fischer Scientific | A451-4 | |
4" Lid | Entegris | H22-401-0615 | Wafer Carriers |
4" tray | Entegris | H22-40-0615 | Wafer Carriers |
Accretech SS10 dicing saw | Accreteck | SS10 | |
Acetone | Fischer Scientific | A18-4 | |
Acetone used in the cleanroom at ORNL | JT Baker | 9005-05 | |
Apples | Grocery store | No product number | |
Arabidopsis thaliana | Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago | No product number | |
Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine | Oak Ridge National Laboratory | Custom-built | |
Cobham Green lettuce | Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis | No product number | Butterhead lettuce |
Fluorescein dye | Sigma Aldrich | F2456-2.5G | |
Gel-box | Gel-Pak | AD-23C-00-X4 | |
Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool | Heidelberg | DWL 66 | |
ImageJ | National Institues of Health | No product number | |
Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL | Doe and Ingalls | CMOS Grade 9079-05 | |
JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system | JEOL | 8100 | |
Kimwipes | Kimtech | Kimberly-Clark Professional 34120 | |
Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish | VWR | 11019-554 | |
Layout Editor | juspertor GmbH | No product number | |
LSM 710 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
LSM 800 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
Make-up applicator | Amazon | G2PLUS | 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS |
Merlin field emission scanning electron microscope | Zeiss | Merlin | |
MIBK/IPA (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) | Microchem | M089025 | |
Onions | Grocery store | No product number | |
Oxford FlexAl atomic layer deposition | Oxford | FlexAl | |
PMMA 495 A4 | Microchem | M130004 | |
PMMA 950 A4 | Microchem | M230004 | Can dilute down to A2 |
Polyethylene terephthalate (PET) | Amazon | KS-6304-21-11 | Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc |
Precision tweezers | Aven Inc. | 18032TT | |
pUBQ10:YFP-GW | Arabidopsis Biological Resource Center | CD3-1948 | |
Silicon etcher (used for descum) | Oxford | Plasmalab | |
Silicon rubber kit | Smooth-On Inc | Ecoflex 00-20 | |
Silicon wafers | Pure Wafer | 4N0.001-.005SSP-INV | |
Spin coater | Brewer Sciences | Model 100CB | |
SPR 955cm 0.7 | Megaposit | 10018314 | |
Strawberries | Grocery store | No product number | |
SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 Series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
SU-8 developer | Microchem | SU-8 2000 Series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
Suss MicroTec contact aligner | Suss MicroTec | MA6/BA6 | |
Table top microscope | Phenom XL | used for checking Ni catalysts after metal deposition | |
Thermionics VE-240 e-beam evaporator | Thermionics | VE-240 |