Her beskriver vi metoder til mikrofabrikation af vertikalt justerede kulstofnanofibre (VACNF’er), overførsel af VACNF’er til fleksible substrater og anvendelse af VACNF’er på både stive og fleksible substrater til planter til levering af biomolekyler og farvestoffer.
Levering af biomolekyler og uigennemtrængelige farvestoffer til intakte planter er en stor udfordring. Nanomaterialer er kommende værktøjer til levering af DNA til planter. Så spændende som disse nye værktøjer er, er de endnu ikke blevet anvendt i vid udstrækning. Nanomaterialer, der er fremstillet på stift substrat (bagside), er særligt vanskelige at anvende med succes på buede plantestrukturer. Denne undersøgelse beskriver processen til mikrofabrikation af vertikalt justerede kulstofnanofiberarrays og overførsel af dem fra et stift til et fleksibelt substrat. Vi detaljerer og demonstrerer, hvordan disse fibre (på enten stive eller fleksible substrater) kan bruges til forbigående transformation eller farvestof (f.eks. Fluorescein) levering til planter. Vi viser, hvordan VACNF’er kan overføres fra stift siliciumsubstrat til et fleksibelt SU-8 epoxysubstrat for at danne fleksible VACNF-arrays. For at overvinde den hydrofobe karakter af SU-8 blev fibre i den fleksible film belagt med et tyndt siliciumoxidlag (2-3 nm). For at bruge disse fibre til levering til buede planteorganer deponerer vi en 1 μL dråbe farvestof eller DNA-opløsning på fibersiden af VACNF-film, venter 10 minutter, placerer filmene på planteorganet og anvender en vatpind med en rullende bevægelse til at drive fibre ind i planteceller. Med denne metode har vi opnået farvestof- og DNA-levering i planteorganer med buede overflader.
Plantetransformation (både forbigående og stabil) er endnu ikke blevet bredt opnåelig i alle plantevæv og arter. Den forbigående transformation af planter er en proces, hvorved gener kodet i plasmider midlertidigt indføres i planter, men ikke stabilt inkorporeres i genomet. Traditionelle metoder, der bruger partikelbombardement, agrobakterier, elektroporation eller polyethylenglycolbehandling af protoplaster, er langsomme eller kan være besværlige. Desuden gælder de ikke for alle plantearter 1,2,3,4. Anvendelsen af nanomaterialer til DNA-levering er et spirende felt, der stadig er i sin vorden5. Nanomaterialer, især kulstofnanofibre, er også med succes blevet brugt til at levere proteiner, dextrans og farvestoffer til planteblade uden at forårsage sårrespons6. Målet med dette arbejde er at tilvejebringe en detaljeret protokol for anvendelse af en type nanomateriale, kulstofnanofibre, til levering af biomolekyler eller farvestoffer til planter. Her fokuserer vi på DNA som det foretrukne biomolekyle, der tillader forbigående transformation af celler i forskellige planteorganer.
Tidligere demonstrerede Morgan et al.7 brugen af kulstofnanofibre fastgjort til stift siliciumsubstrat til forbigående at omdanne blade af salat, N. benthamiana og poppel og både blade og rødder af Arabidopsis. Selvom transformationer var vellykkede på en række organer, var fibre vanskeligere at anvende på plantevæv med buede overflader, såsom rødder eller frugter. Vi ræsonnerede, at en fleksibel bagside til nanofibre kunne forbedre deres effektivitet ved at tilpasse sig bedre til organets form.
Heri beskriver vi metoder, der anvendes til fremstilling og design af vertikalt justerede kulstofnanofibre, overførsel af VACNF’er til fleksible substrater og anvendelse af VACNF’er på både stive og fleksible substrater til planter for at levere biomolekyler og farvestoffer. Kulstofnanofibre blev fremstillet ved hjælp af jævnstrømskatalytisk plasmaforstærket kemisk dampaflejring (dc C-PECVD) med Ni-katalysator. Positionen, diameteren og højden af Ni-katalysatorprikker blev kontrolleret ved hjælp af en kombination af elektronstrålelitografi, metalfordampning og løfteprocesser som beskrevet af Melechko et al.8,9. Ved hjælp af en dobbeltlags e-strålemodstand kan en tykkere Ni-katalysator deponeres på substratet for at give længere fibre10. Fiberoverførsel fra et stift til et fleksibelt substrat er baseret på en modifikation af metoder beskrevet i Fletcher et al.11, hvor de nuværende metoder går forud for brugen af et amorft kulstoflag eller et offerfotoresistlag. SU-8 lift-off med fiberoverførsel opnås ved at udnytte den iboende trækspænding som følge af underbagning og undereksponering af SU-812,13,14. SU-8, en kompleks polymer, er naturligt hydrofob, hvilket gør dens anvendelse til at lette DNA-levering vanskelig. For at modvirke den hydrofobe natur af SU-8 anvender vi et tyndt lag siliciumoxid via atomlagsaflejring15, efter at fibre er indlejret i SU-8. Anvendelse af fibre på et stift substrat til levering af biomolekyler / farvestof udnytter slagkraften fra pincettapning beskrevet i Davern et al.6 og on-plant og on-chip metoderne beskrevet i Morgan et al.7. Fleksible VACNF-film påføres buede planteoverflader ved først at halvtørre DNA- eller farvestofdråber på filmen som med on-chip-metoden fra Morgan et al.7og derefter rulle filmene på buede planteoverflader ved hjælp af en lille makeupapplikator16,17. Figur 1 viser forskellige tilgange til påføring af fibre i stive og fleksible substrater på planter.
I dette papir præsenterede vi metoder til konstruktion af vertikalt justerede kulstofnanofiberarrays, overførsel af fibrene til et fleksibelt substrat og påføring af fibre i enten et stift eller fleksibelt substrat til planter til brug ved levering af biomolekyler eller farvestoffer til planter. Vi beskrev to generelle tilgange, on-chip og on-plant metoderne, til deponering af de introducerede materialer og viste vellykkede resultater i fibre på et stift substrat samt on-chip-metoden ved hjælp af VACNF-film. Anvendelsen af disse fibre er enklere i praksis og teori end traditionelle plantetransformationsmetoder (partikelbombardement, protoplasttransformation via PEG eller elektroporation) og kan anvendes til planter, der er genstridige over for Agrobacterium-medieret transformation. Imidlertid transformeres kun få celler.
Vertikalt justerede kulstofnanofibre blev produceret på Oak Ridge National Laboratory Center for Nanophase Materials Sciences gennem deres brugerprogram. Brugere kan ansøge om at bruge denne facilitet til produktion af VACNF’er. Alternativt kan VACNF-chips fremstilles i renrum med jævnstrømsplasmaforstærkede kemiske dampaflejringsmaskiner med en kulstofkilde22,23. Med de beskrevne metoder er der et par trin, der er kritiske for produktionen af fibrene, fiberoverførsel og anvendelse af VACNF-chips / film. For at fiberapplikation skal fungere, skal fibre være lige og have en tilspidset diameter på <200 nm ved spidsen for levering i planteceller for at være vellykket 6,7 (figur 3). For at skabe kulstofnanofibre af særlig størrelse og tonehøjde er der en række parametre, der kan ændres, herunder prikstørrelse, lateral tonehøjde og mængden af katalysator, der er deponeret. For at vælge den optimale prikstørrelse, der skal bruges til kulstofnanofiberproduktion, blev fibre dyrket fra forskellige prikstørrelser (som vist i figur 5). Vi fandt ud af, at 300 nm diametre producerede de bedste fibre, derfor blev denne prikstørrelse valgt (figur 5). Efter at have fundet de rigtige parametre søgte vi at bruge chips, der har >50% fibre med den ideelle geometri (lige og en spidsdiameter <200 nm). For at kontrollere fibrenes geometri brugte vi scanningelektronmikroskopi til at afbilde tilfældige synsfelter på en prøve af VACNF-chips / film.
Derudover skal fibrene have en vis minimumslængde for at opnå levering inden for planteceller. Betydningen af at producere fibre af forskellig længde er, at længere fibre kan bruges til at trænge ind i dybere vævslag. Længere fibre (>40 μm lange) er afgørende for fleksible film, da fiberoverførslen fungerer ved at bryde fibrene fra deres base og kræver lagdeling af SU-8 oven på fibrene. Arbejdstykkelsen af SU-8-laget, der anvendes til denne protokol, er 20-35 μm. Den mindste højde, der er nødvendig for at opnå levering inden for epidermis af forskellige planter (buet eller flad) er 10-15 μm 6,7. Som et resultat er fibre med længder >40 μm nødvendige for VACNF-film. Der er flere forskellige parametre, der skal overvejes, når der produceres kulstofnanofibre: katalysatormateriale, katalysatorgeometri, tykkelse af katalysatormateriale samt forhold i PECVD-kammeret (gasforhold, tryk, temperatur, strøm, brusehovedhøjde og væksttid)8,9,24,25. For at producere kulstofnanofibre længere end 25 μm anvendt af Morgan et al.7 og Davern et al.6 øgede vi mængden af Ni-katalysator, ændrede acetylen: ammoniakforholdet og øgede strømmen og væksttiden. Derudover var vi mere opmærksomme på katalysatormaterialets geometri. For at producere høje lige fibre skulle den deponerede katalysator have en hockeypuckform snarere end en form, der ligner en vulkan (figur 4). Vulkanstrukturer stammer fra rester af fotoresist efter lift-off. For at forhindre dannelse af vulkaner blev et dobbeltlag PMMA brugt til at skabe en underskæring under elektronstrålelitografi26. Underskæringen hjælper med at løfte den aflejrede metalkatalysator (figur 2). Det tykke lag af katalysatoren er vigtigt for væksten af høje VACNF’er. Morfologien af VACNF’erne er blevet undersøgt af Merkulova et al.24. Den lodrette justering af VACNF’er skyldes både væksten af Ni-katalysatorspidstypen og justeringerne af DC-potentialet vinkelret på substratet (figur 6). Brusehovedet beskriver geometrien af PECVD-reaktoren (figur 6) og tjener som kilde til potentialet for det elektriske felt27.
For at definere rækken af katalysatorprikker med elektronstrålelitografi anvendte vi en elektronstrålemodstand (polymethylmethacrylat) og brugte derefter e-strålen til at lave små huller i modstanden med en bestemt form og på bestemte steder på waferen. Huller med den ønskede diameter blev anbragt på et regelmæssigt gitter med den definerede afstand (stigning), og en fil, der specificerede det ønskede mønster, blev indlæst i elektronstrålelitografiværktøjet, inden substratet blev lagt i maskinen. Ud over fiberhøjde er en anden kritisk parameter for vellykket fiberoverførsel mængden af tid brugt i acetonebadet. VACNF-filmene skal efterlades i acetonebadet længe nok til, at deres kanter begynder at krølle; Hvis de efterlades i acetonebadet i for lidt tid, er de sværere at løfte af chipsene og kan gå i stykker. Jo ældre chipsene er, jo længere bliver de nødt til at forblive i acetonebadet. Efter acetonebadet blev filmene / chipsene anbragt i isopropanol og vand for at fjerne adgangsacetone samt for at fjerne den beskyttende fotoresist på fibrene.
For at udføre spinbelægning placeres wafers eller waferstykker på en vakuumchuck i spincoateren, og waferens centrale position verificeres ved hjælp af spincoaterens testfunktion. En lille vandpyt (~ 2,5 cm i diameter) af modstand påføres midten af waferen og spundet (3000 o / min i 45 s) Billeder af fibrene før og efter spinbelægning er inkluderet i figur 8, der viser bevarelsen af fibergeometri (højde, orientering og stigning). Tilstedeværelsen af fibre får modstanden til at stige godt op i bunden af fibrene og resulterer i tykkere end forventede lag. Spin-coating efter VACNF vækst er blevet undersøgt af andre grupper11,18.
Et andet trin i processen, der er af afgørende betydning, er at sikre, at den rigtige mængde kraft påføres VACNF-chips / film. Leveringsmekanismen er afhængig af, at fibre foretager små punkteringer i cellevægge via pincettens impulskraft, banker på stive underlag 6,7 eller ruller med mini-makeup-applikatoren på fleksible underlag. Fibre kan måske eller måske ikke bryde af og forblive indlejret i planteceller6,7 uden indflydelse på resultatet, men praksis i forbindelse med undersøgelse for farvestofoptagelse og vævsskade er nødvendig for at få trykket rigtigt. Derudover er det vigtigt at vælge passende billeddannelsestidspunkter efter DNA-levering med VACNF-chips/film, da tiden til detekterbar ekspression varierer mellem plantearter og de typer vektorer, der leveres7 (figur 16).
Så bredt anvendelig som denne metode er til planter, har den nogle få begrænsninger. For eksempel resulterer tilsætning af et tyndt lag siliciumoxid til VACNF-filmene ikke altid i, at film er helt hydrofile på grund af det beskyttende lag af fotoresist, der er tilsat oven på SU-8. Hvis dette problem opstår, kan tykkere lag siliciumoxid påføres VACNF’er. For at teste, om filmene er hydrofobe eller hydrofile, kan de placeres i vand. Hvis filmene synker, er de hydrofile, og hvis de flyder, er de hydrofobe. Derudover kan der være variation mellem partier af producerede fibre. Der er flere parametre, der kan ændres, når fibrene dyrkes i dc-PECVD-maskinen; hvad der er beskrevet i denne protokol er et sæt parametre for to forskellige mængder Ni-katalysator. Derudover kan krystalorienteringen af Ni-katalysatoren ikke styres28 , og en vis forgrening vil uundgåeligt resultere i fibrene.
Mens vi demonstrerede leveringen af fluoresceinfarvestof og DNA til planteceller ved hjælp af både stive og fleksible substrater til dette papir, bør metoden være bredt anvendelig til andre biomolekyler og genetiske modifikationsmetoder, for eksempel RNAi-hæmning til plantesystemer som æbler eller andre frugter, hvor det ville tage år at producere stabile transgene linjer. Desuden kan disse fibre også bruges til at levere genetiske redigeringsmaterialer eller til stabile transformationer i planter.
The authors have nothing to disclose.
Nanofiberarrays blev fremstillet på Center for Nanophase Materials Sciences, som er en Department of Energy Office of Science User Facility (forslags-id: CNMS2019-103 og CNMS2022-A-1182). Støtte fra CNMS tildeles gennem et peer-reviewed forslagssystem og ydes uden omkostninger til succesrige ansøgere, der har til hensigt at offentliggøre deres resultater (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). Vi takker Kevin Lester og CNMS for hjælp med produktion af nanofiber arrays. Vi takker Dr. John Caughmen, Dr. Timothy McKnight, Dr. Amber Webb, Daryl Briggs og Travis Bee for kritiske diskussioner om eksperimentelt design. Vi takker Dr. Adam Rondinone for skemaet over PECVD-maskinen. Vi takker Leslie Carol for de videnskabelige illustrationer. Dette arbejde blev finansieret af Bioimaging Science Program, US Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, DE-SC0019104 og United States Department of Agriculture, 2021-67013-34835. JMM blev støttet af United States Department of Agriculture: National Institute of Food and Agriculture: Agriculture and Food Research Initiative Predoctoral Fellowship 2021-67034-35167.
13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct | Fastenal | 690535 | |
2-Propanol (IPA) | Fischer Scientific | A451-4 | |
4" Lid | Entegris | H22-401-0615 | Wafer Carriers |
4" tray | Entegris | H22-40-0615 | Wafer Carriers |
Accretech SS10 dicing saw | Accreteck | SS10 | |
Acetone | Fischer Scientific | A18-4 | |
Acetone used in the cleanroom at ORNL | JT Baker | 9005-05 | |
Apples | Grocery store | No product number | |
Arabidopsis thaliana | Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago | No product number | |
Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine | Oak Ridge National Laboratory | Custom-built | |
Cobham Green lettuce | Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis | No product number | Butterhead lettuce |
Fluorescein dye | Sigma Aldrich | F2456-2.5G | |
Gel-box | Gel-Pak | AD-23C-00-X4 | |
Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool | Heidelberg | DWL 66 | |
ImageJ | National Institues of Health | No product number | |
Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL | Doe and Ingalls | CMOS Grade 9079-05 | |
JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system | JEOL | 8100 | |
Kimwipes | Kimtech | Kimberly-Clark Professional 34120 | |
Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish | VWR | 11019-554 | |
Layout Editor | juspertor GmbH | No product number | |
LSM 710 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
LSM 800 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
Make-up applicator | Amazon | G2PLUS | 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS |
Merlin field emission scanning electron microscope | Zeiss | Merlin | |
MIBK/IPA (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) | Microchem | M089025 | |
Onions | Grocery store | No product number | |
Oxford FlexAl atomic layer deposition | Oxford | FlexAl | |
PMMA 495 A4 | Microchem | M130004 | |
PMMA 950 A4 | Microchem | M230004 | Can dilute down to A2 |
Polyethylene terephthalate (PET) | Amazon | KS-6304-21-11 | Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc |
Precision tweezers | Aven Inc. | 18032TT | |
pUBQ10:YFP-GW | Arabidopsis Biological Resource Center | CD3-1948 | |
Silicon etcher (used for descum) | Oxford | Plasmalab | |
Silicon rubber kit | Smooth-On Inc | Ecoflex 00-20 | |
Silicon wafers | Pure Wafer | 4N0.001-.005SSP-INV | |
Spin coater | Brewer Sciences | Model 100CB | |
SPR 955cm 0.7 | Megaposit | 10018314 | |
Strawberries | Grocery store | No product number | |
SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 Series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
SU-8 developer | Microchem | SU-8 2000 Series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
Suss MicroTec contact aligner | Suss MicroTec | MA6/BA6 | |
Table top microscope | Phenom XL | used for checking Ni catalysts after metal deposition | |
Thermionics VE-240 e-beam evaporator | Thermionics | VE-240 |