Trazabilidad de lípidos de novo mediante el marcaje de isótopos estables LC-TIMS-TOF MS/MS

Al analizar datos de lípidos, el marcaje de isótopos estables (SIL) es un método eficaz para evaluar las vías metabólicas en los organismos vivos. En este método, los átomos dentro de un analito son reemplazados por isótopos estables que contienen ¹³C o ²H. Estos isótopos se incorporan a los precursores, que luego se incrustan dentro de los ácidos grasos, marcando las áreas en las que residen. Con estos isótopos, se puede identificar la distribución y el metabolismo de los lípidos, ya que contrastarán con el fondo no marcado¹. Las plataformas comunes de espectrometría de masas no son capaces de distinguir la señal procedente de las moléculas endógenas². El éxito de SIL requiere el uso de herramientas analíticas de ultra alta resolución. La cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas en tándem de alta resolución, de alta resolución, de concentración paralela, de fragmentación secuencial, de tiempo de vuelo (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) permite la separación de especies marcadas y no marcadas². La ventaja del análisis LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS es que la señal de MS puede ser filtrada por el tiempo de retención (RT) y la movilidad, reduciendo así las posibles interferencias de las moléculas endógenas, así como la cuantificación y separación de todas las especies deseadas². En TIMS, un ion se mantiene primero estacionario contra una fase móvil de gas y posteriormente se libera de acuerdo con su movilidad. Esto proporciona mobilogramas de alta resolución mientras funciona a un voltaje más bajo que la instrumentación IMS anterior³. Los mobilogramas son gráficos de masa a cargar frente a tiempo de deriva que se pueden utilizar para distinguir entre compuestos en función de su tiempo de deriva y la cantidad de superposición⁴.

Mediante el uso de una técnica PASEF adicional, la velocidad de secuenciación aumenta considerablemente sin sacrificar la sensibilidad⁵. La teoría PASEF implica la acumulación de iones seguida de su liberación secuencial en el orden de su movilidad. Esto se hace acumulando iones en alineación paralela a su movilidad. La acumulación de esta manera evita la pérdida de iones. Además, la selección de iones precursores se produce simultáneamente con la acumulación y liberación de los iones. Con este método, PASEF selecciona múltiples precursores en serie durante cada exploración TIMS, en lugar de los precursores individuales por exploración típicos de un instrumento TIMS que no utiliza PASEF. Cuando los iones precursores se acumulan simultáneamente y se liberan en picos de 2 ms dentro de un escaneo TIMS de aproximadamente 100 ms por trama, la señal se amplifica en más de un orden de magnitud, aumentando así la relación señal-ruido³. La adición de PASEF al TIMS aumenta la eficiencia del MS/MS. Dado que el TIMS-PASEF está acoplado con MS/MS, es posible una fragmentación más eficiente. A diferencia de la detección convencional de MS/MS, la señal precursora se comprime desde el TIMS-PASEF, y los iones fragmentados se detectan simultáneamente con el tiempo de elución de TIMS y la posición de movilidad iónica del precursor³.

Al adquirir datos de un espectrómetro de masas, hay opciones en el modo de escaneo deseado. La adquisición dependiente de datos (DDA) selecciona los iones precursores del escaneo MS1 en función de sus abundancias, antes de fragmentarlos y realizar el escaneo MS2. Este modo de escaneo fragmenta tantos precursores como sea posible. El enfoque DDA es específico y los resultados dependerán de la selección de iones³. Sin embargo, DDA-PASEF a menudo tiene problemas en la reproducibilidad entre réplicas. Si bien el DDA es una gran herramienta en un análisis enfocado, las mezclas complejas tienen mayor dificultad en su adquisición de datos⁶. Esto se debe a que solo se puede monitorear una pequeña cantidad de iones simultáneamente³. La adquisición independiente de datos (DIA) es un método en el que las ventanas preseleccionadas de m/z se fragmentan independientemente de su intensidad, y todas se escanean dentro del rango⁷. Con este modo de escaneo, se transmiten nubes iónicas completas desde el IMS al espectrómetro de masas³. En los estudios de proteómica, esto da como resultado que se cuantifiquen mayores cantidades de proteínas en un período de tiempo más corto en comparación con el DDA. Además, DIA omite menos valores m/z en comparación con DDA. Por lo tanto, esta alternativa ha mostrado grandes mejoras en la reproducibilidad de los datos en la relación señal/ruido y una mejor cuantificación que el DDA. En el presente trabajo, nuestro objetivo es implementar DIA al método reportado por Tose et ^al.2. Mejoramos la reproducibilidad y la intensidad de las señales, proporcionando información adicional y más concluyente sobre la movilización, distribución y metabolismo de los lípidos SIL en muestras biológicas aprovechando la adquisición de DDA y DIA.