使用稳定同位素标记 LC-TIMS-TOF MS/MS 从 头 追踪脂质
Summary
这里介绍的是一种利用其保留时间、迁移率和碎裂通过稳定同位素标记来筛选脂质结构的方法。
Abstract
脂质高度多样化，脂质结构和组成的微小变化会对关键的生物学功能产生深远的影响。稳定同位素标记 （SIL） 为研究脂质分布、动员和代谢以及 从头 脂质合成提供了多种优势。SIL 技术的成功实施需要去除内源性分子的干扰。在本工作中，我们描述了一种用于从生物样品中筛选 SIL 脂质的高通量分析方案;将显示蚊子卵巢发育过程中脂质 从头 鉴定的示例。使用互补液相色谱捕获离子淌度光谱和质谱允许在单次扫描 （<1 h） 中从单个样品中分离和分配脂质。所描述的方法利用了数据依赖性采集和数据非依赖性采集的最新发展，在迁移陷阱中使用平行积累，然后是连续碎裂和碰撞诱导解离。脂肪酸链水平的 SIL 测量揭示了蚊子卵巢发育过程中脂质动力学的变化。脂质 从头 结构根据其保留时间、迁移率和碎裂模式进行可靠分配。
Introduction
在分析脂质数据时，稳定同位素标记 （SIL） 是评估生物体代谢途径的有效方法。在这种方法中，分析物中的原子被含有 13C 或 2H 的稳定同位素取代。这些同位素进一步掺入前体中，这些前体随后嵌入脂肪酸中，标记它们所在的区域。使用这些同位素，人们能够识别脂质的分布和代谢，因为它们会与未标记的背景形成对比1。常见的质谱平台无法区分来自内源性分子的信号2。SIL 的成功需要使用超高分辨率的分析工具。液相色谱与高分辨率捕获离子淌度质谱-平行累积顺序碎裂-飞行时间串联质谱 （LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS） 联用，可分离标记和未标记物质2。LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS 分析的优势在于，可以通过保留时间 （RT） 和淌度过滤 MS 信号，从而减少内源性分子的潜在干扰，以及所有所需物质的定量和分离2。在 TIMS 中，离子首先在气体流动相上保持静止，然后根据其迁移率释放。这提供了高分辨率的移动图，同时在比早期 IMS 仪器更低的电压下运行3.移动量图是质量电荷与漂移时间的关系图，可用于根据化合物的漂移时间和重叠量来区分化合物4。
通过使用额外的 PASEF 技术，在不牺牲灵敏度的情况下大大提高了测序速度5。PASEF 理论涉及离子的积累，然后按照其迁移率的顺序顺序顺序释放。这是通过积累离子与其淌度平行来实现的。以这种方式积累可以防止离子损失。此外，母离子选择与离子的积累和释放同时发生。使用这种方法，PASEF 在每次 TIMS 扫描期间选择多个串联的母离子，而不是不使用 PASEF 的 TIMS 仪器通常每次扫描选择单个母离子。当母离子在每帧约 100 ms 的 TIMS 扫描中以 2 ms 的峰值同时积累和释放时，信号被放大超过一个数量级，因此信噪比增加3。在 TIMS 中增加 PASEF 可提高 MS/MS 的效率。由于 TIMS-PASEF 与 MS/MS 联用，因此可以实现更高效的碎裂。与传统的 MS/MS 检测不同，母离子信号从 TIMS-PASEF 压缩，碎片离子与母离子3 的 TIMS 洗脱时间和离子淌度位置同时检测。
从质谱仪采集数据时，扫描模式中有一些选项。数据依赖性采集 （DDA） 根据母离子的丰度从 MS1 扫描中选择母离子，然后将其碎裂并执行 MS2 扫描。此扫描模式会碎裂尽可能多的 precursors。DDA 方法是有针对性的，结果将取决于离子选择3。然而，DDA-PASEF 在重复之间的重现性方面经常存在问题。虽然 DDA 是重点分析的出色工具，但复杂混合物的数据采集难度更大6。这是因为只能同时监测少量离子3。数据非依赖型采集 （DIA） 是一种方法，其中 m/z 的预选窗口独立于其强度进行碎裂，并且所有窗口都在7 范围内进行扫描。使用这种扫描模式，整个离子云从 IMS 传输到质谱仪3。在蛋白质组学研究中，与 DDA 相比，这导致在更短的时间内定量了更多的蛋白质。此外，与 DDA 相比，DIA 遗漏的 m/z 值更少。因此，这种替代方案在信噪比的数据重现性和比 DDA 更好的定量方面显示出很大的改进。在这项工作中，我们的目标是将 DIA 实施到 Tose 等人 2 报告的方法。我们提高了信号的可重复性和强度，利用 DDA 和 DIA 采集获得了有关生物样品中 SIL 脂质动员、分布和代谢的进一步和更确凿的信息。
Protocol
Representative Results
Discussion
在评估该方案的使用情况时，必须确保 DIA-PASEF 和 MS/MS 参数适用于所讨论的甘油三酯。具体来说，活动窗口和窗口宽度应遵循甘油三酯的模式。这可以通过使用 DDA 方法的上一次运行来确定。在追踪内标中的甘油三酯时，DIA 设置的窗口应覆盖所有预先确定的目标分子。窗口的大小应相等，范围在所需化合物的 m/z 和 1/k0 范围内（图 7）。如果窗口大小不正确，将跳过要碎裂的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢 Cesar Ramirez 博士在初始方法开发过程中的贡献。这项研究由捷克共和国捷克科学基金会向明尼苏达州提供的 NIAID 赠款 22-21244S 项目 R21AI167849 资助。
Materials
| Accucore C30 colum | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Bruker Compass Data Analysis | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | Version 5.2 |
| d-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| glass vials | Thermo Fisher Scientific | 11-417-236 | |
| heavy water (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| polypropylene pestles | Fisher Scientific | BAF199230001 | |
| Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph | Shimadzu | L20234651907 | |
| silanized glass inserts | Thermo Fisher Scientific | 03-251-826 | |
| Sucrose-13C12 | Sigma-Aldrich | 605417 | |
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| Tuning Mix Calibration Standard | Agilent Technologies | 36 |
References
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