Expresión de transgenes en células cultivadas utilizando vectores virales adenoasociados recombinantes no purificados

1. Adquisición de plásmidos NOTA: Este protocolo clonará un gen de interés (GOI) en un plásmido que contiene ITR con un promotor de citomegalovirus (CMV) y una secuencia de poliadenilación SV40 (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40). Sin embargo, este plásmido se puede usar sin clonación adicional para producir rAAV, empaquetando un conveniente reportero dual de EGFP y luciferasa. Los plásmidos con diferentes elementos reguladores o para diferentes aplicaciones, como los experimentos basados en CRISPR, están disponibles en línea y seguirán pasos de clonación similares a los que se indican a continuación (consulte la discusión para conocer los pasos de clonación adicionales). Además, se pueden usar plásmidos rep/cap o trans para diferentes serotipos: este protocolo usará rep/cap para el serotipo 2 de AAV. Compre puñaladas bacterianas que contengan un plásmido cis que contenga ITR, un plásmido auxiliar de adenovirus, un plásmido rep/cap y un plásmido que contenga un GOI. Raye las bacterias en placas de agar individuales que contengan antibióticos específicos para la resistencia de cada plásmido. Incubar las bacterias a 30 °C durante la noche para que crezcan.NOTA: Si un plásmido con un GOI no está disponible para su compra, se puede comprar en línea un fragmento de ADN sintético (consulte la Tabla de materiales). Además, se puede utilizar un fragmento de ADN sintético para omitir todo el proceso de PCR si se desea. Recoger una sola colonia de cada placa y cultivar en 3 mL de tampón Luria Bertani (LB) suplementado con el antibiótico correspondiente a 30 °C durante la noche, agitando a 180 rpm. Transfiera 1 mL de la bacteria a un matraz estéril de Erlenmeyer de 250 mL que contenga 50 mL de tampón LB suplementado con el antibiótico correspondiente. Agitar a 30 °C, 180 rpm durante la noche. Transfiera las bacterias a un tubo cónico de 50 ml y centrifugue durante 20 minutos a 3.000 x g, temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Aísle el plásmido usando un kit de preparación midip bajo o libre de endotoxinas según las instrucciones del fabricante.NOTA: Los RTI son estructuras inestables. Para evitar deleciones o mutaciones en el ITR, las células bacterianas deben cultivarse a 30 °C para ralentizar la división celular y mitigar los errores de replicación. Para aumentar el rendimiento y la pureza de los plásmidos, lo ideal es un kit midiprep o maxiprep. Se recomienda utilizar un kit bajo en endotoxinas o libre de endotoxinas para reducir la contaminación de las células por endotoxinas aguas abajo. No es necesario realizar el aislamiento de plásmidos dentro de una campana de flujo laminar, ya que la contaminación de la preparación de plásmidos no es probable si se realiza en un banco estándar. 2. Clonación de un gen de interés en un plásmido que contiene AAV ITR Abra el mapa de plásmidos que contiene el GOI en un software de visualización de ADN.NOTA: El casete completo, incluidos los RTI, no debe exceder los 4,9 kb debido a las limitaciones físicas de empaquetado de la cápside. Además, la amplificación por PCR no se puede lograr a través de ITR debido a estructuras secundarias. Como tal, no se recomienda el ensamblaje de Gibson para la clonación de transgenes rAAV.Haga clic en la pestaña Secuencia para mostrar la secuencia completa del plásmido. Desplácese hasta la región más 5′ de la secuencia GOI y haga clic en el primer nucleótido mientras arrastra hacia adentro hacia el cuerpo del gen para crear un cebador hacia adelante. Liberar una vez que se haya alcanzado una temperatura de fusión (Tm) de ~55 °C. Haga clic en Imprimación hacia adelante. Incluya manualmente la secuencia para un sitio de restricción EcoRI (5′ GAATTC 3′) en el extremo 5′ de la secuencia del cebador. Además, agregue seis bases aleatorias adicionales en el extremo 5′ de este sitio de restricción para permitir que la enzima interactúe de manera eficiente con el ADN. Haga clic en Agregar imprimación. Consulte la Figura 2 para ver un ejemplo representativo. Revise la imprimación para asegurarse de que no pueda formar horquillas o dímeros de imprimación (excepto para el sitio de restricción que es palindrómico). Si se forman horquillas, cambie la secuencia aleatoria de las seis bases adicionales. Además, asegúrese de que el cebador no se una a ninguna otra parte del plásmido. Repita los pasos para crear un cebador inverso en la región más 3′ del GOI hacia el interior del cuerpo del gen. Haga clic en Reverse Primer e incluya un sitio de restricción NotI (5′ GCGGCCGC 3′).NOTA: El Gobierno de la India no puede contener sitios de restricción EcoRI o NotI; si es así, será necesario utilizar diferentes enzimas de restricción. Amplificar el GOI en una reacción de PCR de 50 μL. Utilice los componentes individuales necesarios de la Tabla 1.Coloque la reacción en un termociclador y siga los parámetros del ciclo de la Tabla 2 para la programación. Si los cebadores tienen diferentes T m, utilice el Tm inferior para el programa. Verifique la amplificación del fragmento de PCR correcto agregando 1 μL de colorante de carga de gel (6x) a 5 μL de reacción de PCR. Ejecute una escalera de ADN y la mezcla de PCR en un gel de agarosa al 0,8% que contenga bromuro de etidio y visualice con luz ultravioleta.PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es un mutágeno conocido. Si aparece una sola banda específica en el gel, purifique el producto de PCR restante en el tubo de tira de PCR utilizando un kit de limpieza de PCR basado en columna según las instrucciones del fabricante. Si aparecen varias bandas (debido a una amplificación no específica), extirpe la banda deseada y purifique el ADN con un kit de extracción en gel según las instrucciones del fabricante. Digiera el producto de PCR purificado y el plásmido de esqueleto pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 en una reacción de 50 μL con los componentes individuales requeridos de la Tabla 3 durante 1 h a 37 °C. Se requiere una mayor cantidad de ADN plasmídico pAAV debido a la recuperación ineficiente esperada después de la extracción en gel.NOTA: Las enzimas de restricción utilizadas son versiones de alta fidelidad (HF). Regular NotI no se puede utilizar con el búfer CutSmart. Si se utilizan diferentes enzimas, es posible que se requiera una temperatura de incubación y un tampón diferentes.Purifique el producto de PCR digerido con un kit de limpieza de PCR basado en columna según las instrucciones del fabricante. Prepare el plásmido de esqueleto pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 digerido para la electroforesis en gel agregando 10 μL de colorante de carga de gel (6x) a 50 μL de reacción de digestión. Cargue una escalera de ADN, una reacción de digestión y 250 ng de plásmido no digerido (control negativo) en un gel de agarosa al 0,8% que contenga bromuro de etidio con pocillos de dientes anchos. Visualice con luz ultravioleta, extirpe el fragmento deseado (~4,5 kb) y purifique el ADN utilizando un kit de extracción en gel según las instrucciones del fabricante. Ligue el producto de PCR digerido y el plásmido primario de pAAV digerido en una reacción de ligadura de 20 μL con los componentes individuales requeridos de la Tabla 4. Para calcular la cantidad de productos de PCR necesarios, utilice la Fórmula 1. Normalmente, se utiliza una relación molar de 3:1 entre el producto de la PCR (inserto) y la columna vertebral (pAAV), con una masa de 50 ng de la columna vertebral.Fórmula 1 Realice un control negativo sustituyendo el producto PCR por agua. Incubar las reacciones de ligadura a 16 °C durante la noche o a temperatura ambiente durante 2 h. Descongele un vial de células bacterianas competentes con deficiencia de recombinación (como las células Stbl3) en hielo y coloque 50 μL en un tubo de 1,5 ml. Añadir 3 μL de la reacción de ligadura directamente sobre las células e incubar en hielo durante 30 min.NOTA: Los ITR son estructuras inestables y, por lo tanto, requieren cepas bacterianas deficientes en recombinación para limitar los eventos de deleción y recombinación de ITR. Las células DH5α se pueden utilizar de forma intermitente para la propagación (una o dos veces), pero no se recomiendan para su uso a largo plazo. La integridad del ITR debe comprobarse regularmente después de la purificación de midiprep.Aplicar un choque térmico a las bacterias en un baño de agua a 42 °C durante 30 s y luego transferirlas inmediatamente a hielo durante 2 min. Añadir 200 μL de tampón LB y agitar durante 1 h a 30 °C, 180 rpm. Extender 125 μL de la mezcla en una placa de agar con el antibiótico correspondiente e incubar durante la noche (~18 h) a 30 °C. Elija varios clones y colóquelos en un tubo de cultivo de plástico estéril con 3 ml de LB que contenga el antibiótico correspondiente. Incubar durante la noche agitando a 30 °C, 180 rpm.NOTA: Para evitar deleciones o mutaciones en el ITR, las células bacterianas deben cultivarse a 30 °C para ralentizar la división celular y mitigar los errores de replicación. Además, se deben elegir colonias más pequeñas, ya que las que no tienen RTI pueden tener una ventaja de crecimiento sobre otras. Pipetear 1,8 ml de cada cultivo en un tubo de 2 ml y centrifugar a 6.000 x g durante 3 min, a temperatura ambiente. Aísla el ADN con un kit de minipreparación. Almacenar los 1,2 ml restantes de cultivo a 4 °C. Verifique los clones correctos mediante secuenciación de ADN o digestión de enzimas de restricción diagnóstica.NOTA: Se recomienda la secuenciación Sanger del inserto, pero la procesividad a través de ITR no se puede lograr con métodos estándar. Los RTI deben verificarse mediante un resumen de restricción, como se describe a continuación. Añadir 50 ml de tampón LB que contiene el antibiótico correspondiente a un matraz Erlenmeyer estéril de 250 ml. Añadir 500 μL del cultivo restante al matraz y agitar a 30 °C, 180 rpm hasta alcanzar un DE600 de 0,2-0,5 (~18 h). Transfiera las bacterias a un tubo cónico de 50 ml y centrifugue durante 20 min a 3.000 x g, 4 °C. Aísle el ADN utilizando un kit de preparación midiprep bajo o libre de endotoxinas. Compruebe la integridad de la ITR con 20 μL de digestión de la enzima de restricción diagnóstica utilizando XmaI (o SmaI). Prepare una reacción que contenga 500 ng de plásmido, 0,5 μL de enzima y 1x tampón; incubar durante 1 h a 37 °C. Ejecute la reacción en un gel de agarosa al 0,8%. Si los ITR están intactos, la digestión dará una banda a ~2,9 kb y otra banda del tamaño del casete. Si no se observa esta banda distintiva, es posible que el ITR no esté intacto y que sea necesario volver a realizar la clonación.NOTA: Los plásmidos que contienen sitios de restricción XmaI (o SmaI) (además de los del ITR) tendrán bandas adicionales en el gel. Figura 2: Ejemplo representativo para el diseño de imprimación. Diseño de cebador directo e inverso para un transgén mScarlet (ejemplo representativo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Importe Componente X μL Plantilla de ADN (25 ng) 1 μL Imprimación F (10 μM) 1 μL Imprimación R (10 μM) 1 μL dNTP (10 mM) 10 μL Búfer de Phusion (5x) 1 μL Phusion Polimerasa X μL Agua 50 μL Volumen final Tabla 1: Reactivos de amplificación por PCR. Los componentes necesarios para una reacción de PCR exitosa. Paso Temperatura Hora Desnaturalización inicial 98 °C 1 minuto 30 Ciclos 98 °C 10 s Tm de imprimación 30 s 72 °C 30 s por kb Extensión final 72 °C 10 minutos Sostener 4 °C indefinidamente Tabla 2: Programación de amplificación por PCR. Los parámetros cíclicos necesarios para una reacción de PCR exitosa. Importe Componente X μL Producto de PCR (1 μg) o plásmido pAAV (3 μg) 5 μL Búfer (10x) 1 μL EcoRI-HF 1 μL NotI-HF X μL Agua 50 μL Volumen final Tabla 3: Reactivos de digestión. Los componentes necesarios para una reacción digestiva exitosa. Importe Componente X μL Insertar (X ng) X μL Red troncal (50 ng) 2 μL Tampón de ADN ligasa T4 (10x) 1 μL ADN ligasa T4 X μL Agua 20 μL Volumen final Tabla 4: Reactivos de ligadura. Los componentes necesarios para una reacción de ligadura exitosa. 3. Producción de vectores con transfección de plásmidos triples NOTA: Los siguientes valores están optimizados para un solo pocillo de una placa de 6 pocillos que produce un volumen final de preparación de crudo de 2 mL. Todos los valores pueden ampliarse 10 veces para una placa de 15 cm que produce un volumen final de 20 ml o reducirse 4 veces para una placa de 24 pocillos con un volumen final de 500 μl. Prepare una reserva de 1 μg/μL de clorhidrato de polietilenimina (PEI) MAX disolviendo 100 mg de PEI MAX en 100 ml de agua destilada. Ajuste el pH a 7.1 con NaOH. Filtrar: esterilizar la mezcla con un filtro de 0,22 μm y congelar alícuotas de 1 ml a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo. Una vez descongelado, conservar el reactivo durante 1 mes a 4 °C. Siembre 3 x 10 5células HEK293 o HEK293T en una placa de 6 pocillos con medio de águila modificado de Dulbecco precalentado (DMEM, 4,5 g/L de glucosa, 110 mg/L de piruvato de sodio) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%. Crecer hasta ~75%-90% de confluencia en una incubadora ajustada a 37 °C y 5% de CO2 (Figura 3).NOTA: Se ha observado que las células cultivadas con penicilina/estreptomicina (P/S) disminuyen el rendimiento de la producción de vectores. El uso de una técnica estéril adecuada evita la necesidad de utilizar P/S, por lo que se recomienda no cultivar células HEK293 con el antibiótico20. Si se requiere P/S en las transducciones posteriores, se recomienda agregar P/S a la preparación del crudo después de la cosecha. En un tubo de 2 ml, prepare una mezcla que contenga 1,3 μg de pAAV2/2 (Rep/Cap, serotipo 2), 1,3 μg de pAAV.GOI, 2,6 μg de pAdΔF6 y DMEM sin suero (4,5 g/L de glucosa, 110 mg/L de piruvato de sodio) en un volumen total de 100 μL (consulte la Tabla complementaria 1 para cálculos convenientes). Prepare un control negativo en un tubo separado reemplazando pRep/Cap con cualquier plásmido no relacionado. El testigo negativo tiene en cuenta el plásmido pAAV.GOI no empaquetado presente en la preparación cruda que posiblemente podría transfectar células durante la transducción, aunque es raro.NOTA: El plásmido maxiprep o midiprep bajo o libre de endotoxinas es ideal para la triple transfección y, por lo general, produce un vector de título más alto en comparación con el ADN de miniprep, aunque el ADN de miniprep se puede usar para pruebas preliminares rápidas y sucias. Añadir 5,2 μL de PEI MAX a la mezcla de plásmidos; se trata de una mezcla de plásmido:PEI con una proporción de 1:1. Mezcle bien pulsando de 10 a 15 veces en un mezclador de vórtice ajustado a 7. Si se producen varias preparaciones de vectores, agregue PEI a cada mezcla de plásmidos a intervalos de tiempo escalonados de 1 min (es decir, la preparación 1 a t = 0 min, la preparación 2 a t = 1 min, etc.) para permitir un tiempo suficiente para aspirar los pocillos y diluir la reacción en los siguientes pasos.NOTA: Se ha observado que una proporción de 1:1 de plásmido:PEI es óptima. Sin embargo, los usuarios individuales pueden optimizar esta relación para obtener la máxima eficiencia. Consulte la discusión sobre cómo realizar la optimización de PEI (consulte también la Tabla complementaria 2). Incubar cada tubo durante exactamente 15 minutos y luego diluir la reacción con 1,9 ml de SF DMEM (4,5 g/L de glucosa, 110 mg/L de piruvato de sodio) para obtener un volumen final de 2 ml. Pipetear suavemente 2 veces para mezclar. La mezcla excesiva interrumpirá los complejos plásmido/PEI y dará como resultado una menor eficiencia de transfección. Aspire los medios del pocillo y agregue suavemente la mezcla de plásmido:PEI en los lados del pocillo para evitar el desprendimiento celular. Incubar las células durante 72 h a 37 °C y 5% de CO2. La lisis celular y el desprendimiento durante la incubación es un proceso normal de producción de rAAV (Figura 4). Figura 3: Células HEK293 listas para la transfección. La confluencia ideal (75%-90%) de células HEK293 necesarias para la transfección de plásmidos triples. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Células HEK293 después de la transfección. La aparición de células HEK293 antes y después de 1, 2 o 3 días después de la transfección con pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 y una relación 1:1 de plásmido:PEI. Barras de escala: 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 4. Cosecha de preparaciones de vectores crudos Congelar toda la placa de células transfectadas durante 30 min a -80 °C, seguido de una descongelación durante 30 min a 37 °C. Repita para un total de tres ciclos de congelación/descongelación. No retire la tapa, la placa debe permanecer estéril en el interior. Las placas pueden permanecer a -80 °C hasta que estén listas para continuar con los siguientes pasos.NOTA: Una incubadora no humidificada funciona mejor para descongelar, lo que minimiza la condensación en el exterior de las placas que puede provocar una contaminación accidental. Realice los siguientes dos pasos en una campana de flujo laminar utilizando técnicas asépticas. Mezcle cada pozo pipeteando para garantizar la máxima interrupción de las células. Transfiera el lisado a un tubo de 2 ml y centrifugue durante 15 minutos a 15.000 x g, temperatura ambiente para eliminar los restos celulares. Transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo de 2 ml. Esta preparación cruda se puede utilizar inmediatamente sin valoración ni purificación. El vector puede almacenarse a 4 °C durante varios meses o a -20 °C durante años.NOTA: Si es necesario, los títulos pueden calcularse mediante PCR cuantitativa (qPCR) cuantificando el número de genomas de vectores (VG) dentro de las partículas resistentes a la DNasa. Como tal, los títulos se dan en unidades de VG/mL. El vector almacenado durante varios meses a 4 °C debe volver a valorarse antes de su uso, ya que el vector puede agregar y/o unir las paredes del tubo, reduciendo el título de la preparación. 5. Transducción Coloque la placa del tipo de célula deseado (p. ej., Huh7) en una placa de 96 pocillos con una confluencia objetivo del 50 % al 75 %, dependiendo de la duración de la transducción. Una mayor confluencia puede resultar en una reducción de la eficiencia de la transducción de AAV. Agregue vector (p. ej., CMV.mScarlet) a las células sin conocer el título de la preparación cruda para aplicaciones en las que la dosis no es relevante, como probar un panel de cápsidas para la transducción en un nuevo tipo de célula. Realizar una serie de diluciones 1:3 de la preparación cruda en medios libres de suero (SF) para obtener la cantidad óptima de vector requerida para la aplicación. Aspire los medios de la placa de 96 pocillos y agregue 50-100 μL de preparación cruda diluida a los pocillos. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2.NOTA: El suero puede contener anticuerpos que pueden neutralizar el vector AAV y reducir la eficiencia de la transducción. Sin embargo, el suero se puede utilizar durante la transducción para tipos de células sensibles. Retire el vector después de 48 h después de la transducción (hpt) y lave las células una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) precalentada. Los vectores también pueden eliminarse y sustituirse por medios que contengan suero a partir de 2 hpt para los tipos de células sensibles. Para muchas aplicaciones, realice la incubación durante la noche para transducir las células y reemplazar los pocillos con medios frescos que contengan suero por la mañana. Los tipos de células robustas, como Huh7 y U2-OS, no requieren un cambio de medio. Finalice la transducción fijando las células en paraformaldehído (PFA) al 4% durante 10 min. También se pueden utilizar varios métodos de terminación en función de la aplicación (por ejemplo, lisis). Para la mayoría de los tipos de células, la expresión máxima se produce a las 48 hpt y, por lo tanto, es un criterio de valoración experimental común. 6. Variaciones en el método de transducción por tipo de célula NOTA: Los diferentes tipos de células requieren diferentes condiciones de cultivo. Por lo tanto, la adición de vector para la transducción debe optimizarse en función de las necesidades del tipo de célula. A continuación se presentan protocolos de transducción muy específicos para los tipos de células incluidos en los resultados representativos, que ilustran algunas variaciones de los protocolos de transducción que un investigador puede desear probar para sus propias necesidades. Organoides del intestino delgado de ratónDerivar organoides del intestino delgado (mSIO) de ratón a partir de una preparación de cripta del intestino delgado de ratones C57BL/6J. Incrustar organoides en una matriz de membrana basal al 90 % y cultivarlos en placas de 24 pocillos que contengan medio de crecimiento de organoides (sin antibióticos) o medio de pretransducción (medio acondicionado con Wnt3a al 50 % [producido internamente utilizando células L Wnt-3A en medio de crecimiento de organoides], 10 mM de nicotinamida, 10 μM de inhibidor de ROCK y 2,5 μM de CHIR99021) durante un paso (5-7 días) antes de la transducción a 37 °C y 5% de CO2. Antes de la transducción, enjuague los organoides con D-PBS, rompa las cúpulas de la matriz de la membrana basal mediante pipeteo y disocie los organoides en pequeños grupos de células incubándolos en medio de disociación durante 10 minutos a 37 °C y pipeteando más. Detenga el proceso de disociación celular agregando 5% de FBS en DMEM/F-12 con 15 mM HEPES, transfiera los grupos celulares a tubos de centrífuga y recoja los grupos celulares por centrifugación durante 5 min a 1000 x g, temperatura ambiente. Vuelva a suspender los grupos celulares en un medio de transducción (medio de pre-transducción que contenga 10 μg/mL de polibreno o medio de crecimiento de organoides que contenga 10 μg/mL de polibreno) y transfiéralos a placas de 48 pocillos, seguido de la adición de preparaciones crudas de AAV que envasan CMV.mScarlet para la transducción. Realizar la transducción de organoides centrifugando la placa durante 1 h a 600 x g y 37 °C y luego incubar a 37 °C durante 6 h adicionales. Recoja los organoides transducidos en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, centrifugue durante 5 minutos a 1000 x g, temperatura ambiente, y póngalos en hielo. Después de retirar el sobrenadante, resuspender los organoides transducidos en una matriz de membrana basal al 90% en un medio de pretransducción o en un medio de crecimiento de organoides y gotas de semillas de 20 μL en un pocillo de un cubreobjetos con cámara precalentado. Después de la incubación durante 10 minutos en la incubadora, incrustar la gota en 350 μL de medio de pre-transducción o medio de crecimiento de organoides e incubar a 37 °C en la incubadora. Determinar la eficiencia de la transducción 2-5 días después de la transducción mediante la obtención de imágenes de los organoides transducidos en un microscopio confocal y estimar el porcentaje de células fluorescentes rojas por organoide. Células BeWoA las 24 h antes de la transducción, placa de células BeWo de coriocarcinoma placentario humano a 10.000 células por pocillo de placa de 96 pocillos. Diluir las preparaciones crudas de AAV envasado CMV.mScarlet a 1:1 en medio F12-K BeWo sin suero hasta un volumen total de 50 μL por pocillo. Aspire el medio del pocillo y reemplácelo con 50 μL de AAV diluido por pocillo. Incubar las células a 37 °C durante la noche (~18 h) y luego añadir 100 μL de medio F12-K BeWo que contenga un 10% de FBS para aumentar el volumen total a 150 μL. Incubar las células durante 6 h adicionales para un total de 24 h después de la transducción (hpt). Para la obtención de imágenes, tiña las células vivas con el colorante Hoechst durante 30 minutos en medio F12-K, luego cambia el medio por DMEM sin fenol que contenga un 10 % de FBS, 1 suplemento de glutamax y 1 suplemento de piruvato de sodio para la obtención de imágenes. Realice imágenes de células vivas en un microscopio confocal utilizando juegos de filtros DAPI (para imágenes de Hoechst) y mCherry (para imágenes de mScarlet) con 37 °C y 5% de CO2. Células Hepa1-6 y Huh7Placa de células hepáticas Hepa1-6 murinas y células hepáticas humanas Huh7 en DMEM (4,5 g/L de glucosa, 110 mg/L de piruvato de sodio, 10% FBS) a 5.000 células por pocillo de una placa de 96 pocillos 24 h antes de la transducción. Añadir 50 μL de preparados crudos de AAV sin diluir para envases CMV.mScarlet directamente a las células e incubar a 37 °C durante 48 h. Lave las células una vez en PBS, fíjelas en PFA al 4% y tiña con tinte Hoechst durante 10 minutos. Realice la obtención de imágenes en un microscopio confocal utilizando los conjuntos de filtros DAPI (para la obtención de imágenes de Hoechst) y mCherry (para la obtención de imágenes de mScarlet). Células C2C12 y HSkMCPlaca de mioblastos murinos indiferenciados C2C12 y mioblastos indiferenciados de células musculares esqueléticas primarias humanas (HSkMC) a 5.000 células por pocillo de una placa de 96 pocillos, 72 h antes de la transducción. Diluir las preparaciones crudas de AAV que envasan CMV.mScarlet a 1:1 en DMEM (4,5 g/L de glucosa, Penn/Strep, 20% FBS) para mioblastos C2C12 o medios de crecimiento del músculo esquelético para mioblastos HSkMC. Diferencie los mioblastos de HSkMC a miotubos cambiando el medio a medio de diferenciación. Incubar mioblastos y miotubos en preparaciones diluidas de AAV durante 24 h a 37 °C. Tiña las células vivas con el colorante Hoechst durante 10 minutos y toma imágenes en un microscopio confocal utilizando los conjuntos de filtros DAPI (para imágenes de Hoechst) y mCherry (para imágenes de mScarlet).