프리온 유발 염증을 줄이기 위해 원발성 혼합 신경교세포와 공동 배양된 지방 유래 중간엽 기질 세포
Summary
지방 유래 중간엽 기질 세포(AdMSC)는 염증과 관련된 질병을 치료하는 데 유용한 강력한 면역 조절 특성을 가지고 있습니다. 쥐 AdMSC와 원발성 혼합 신경교세포를 분리 및 배양하고, AdMSC를 자극하여 항염증 유전자 및 성장 인자를 상향 조절하고, AdMSC의 이동을 평가하고, 원발성 혼합 프리온 감염 신경교세포와 AdMSC를 공동 배양하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
중간엽 기질 세포(MSC)는 항염증성 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자의 생성을 통해 염증을 강력하게 조절합니다. 이 세포는 프리온 질환 및 기타 단백질 접힘 장애와 같은 신경 퇴행성 질환의 맥락에서 신경 염증을 조절하는 능력을 보여줍니다. 프리온 질환은 산발적이거나, 후천적이거나, 유전적일 수 있습니다. 이는 뇌에서 프리온 단백질의 잘못된 접힘과 응집으로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 질병은 항상 치명적이며 사용할 수 있는 치료법이 없습니다.
질병의 초기 징후 중 하나는 성상교세포와 미세아교세포의 활성화 및 관련 염증으로, 이는 감지 가능한 프리온 응집과 신경 세포 손실 이전에 발생합니다. 따라서 MSC의 항염증 및 조절 특성을 수확하여 프리온 질환에서 성상교증을 치료할 수 있습니다. 최근에는 BV2 세포 또는 원발성 혼합 신경교세포와 함께 배양한 지방 유래 MSC(AdMSCs)가 파라크린 신호전달을 통해 프리온 유발 염증을 감소시킨다는 것을 보여주었습니다. 이 논문은 프리온 유발 염증을 줄이기 위해 자극된 AdMSC를 사용하는 신뢰할 수 있는 치료법에 대해 설명합니다.
AdMSC의 이형접합 집단은 쥐 지방 조직에서 쉽게 분리하고 배양에서 확장할 수 있습니다. 염증성 사이토카인으로 이러한 세포를 자극하면 프리온에 감염된 뇌 균질화로 이동하고 이에 대한 반응으로 항염증 조절제를 생성하는 능력이 향상됩니다. 이러한 기법은 프리온 감염에 대한 MSC의 치료 가능성을 조사하는 데 사용할 수 있으며 다른 단백질 접힘 및 신경 염증성 질환에도 적용할 수 있습니다.
Introduction
신경교세포 염증은 파킨슨병, 알츠하이머병, 프리온 질환 등 다양한 신경퇴행성 질환에서 중요한 역할을 합니다. 비정상적인 단백질 응집은 질병 발병 기전과 신경 퇴행의 많은 원인에 기인하지만, 신경교세포(glial cell)도 이 1,2,3을 악화시키는 역할을 합니다. 따라서 신경교세포 유발 염증을 표적으로 하는 것은 유망한 치료법입니다. 프리온 질환에서 세포 프리온 단백질(PrPC)은 질병 관련 프리온 단백질(PrPSc)로 잘못 접혀 올리고머를 형성하고 응집하여 뇌의 항상성을 방해합니다 4,5,6.
프리온 질환의 초기 징후 중 하나는 성상교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)의 염증 반응입니다. 미세아교세포(microglia)를 제거하거나 성상세포(astrocyte)를 변형시켜 이러한 반응을 억제하는 연구는 일반적으로 동물 모델에서 질병 발병기전을 개선하지 않거나 악화시키는 것으로 나타났습니다 7,8,9. 신경교 염증을 제거하지 않고 조절하는 것은 치료법으로서 흥미로운 대안입니다.
중간엽 기질 세포(MSCs)는 파라크린 방식으로 염증을 조절하는 능력으로 인해 다양한 염증성 질환의 치료법으로 자리 잡았습니다 10,11. 그들은 항염증 분자, 성장 인자, microRNA 등을 분비함으로써 염증 부위로 이동하고 이러한 환경에서 신호 분자에 반응하는 능력을 보여주었습니다 10,12,13. 우리는 이전에 지방 조직에서 유래한 MSC(AdMSC로 표시)가 프리온에 감염된 뇌 균질액으로 이동하고 항염증성 사이토카인 및 성장 인자에 대한 유전자 발현을 상향 조절함으로써 이 뇌 균질액에 반응할 수 있음을 입증했습니다.
또한, AdMSC는 BV2 미세아교세포와 원발성 혼합교세포(primary mixed glia 14) 모두에서 3(NLRP3) 인플라마좀 신호전달 및 신경교세포 활성화를 포함하는 Nod-Like Receptor family pyrin domain인 Nuclear Factor-kappa B(NF-κB)와 관련된 유전자의 발현을 감소시킬 수 있습니다. 여기에서는 마우스에서 AdMSC와 원발성 혼합 신경교세포를 모두 분리하고, AdMSC를 자극하여 조절 유전자를 상향 조절하고, AdMSC 이동을 평가하고, AdMSC를 프리온 감염 신경교세포와 함께 배양하는 방법에 대한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 이러한 절차가 신경 퇴행성 및 기타 질병에서 신경교 유발 염증을 조절하는 데 있어 MSC의 역할에 대한 추가 연구를 위한 기초를 제공할 수 있기를 바랍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 신경교세포 모델에서 프리온 유발 염증을 감소시키는 지방 유래 중간엽 기질 세포(AdMSCs)의 효과를 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 상대적으로 저렴한 프로토콜을 보여줍니다. AdMSC는 배양에서 쉽게 분리하고 증식하여 1주일 이내에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 면역형광 및 유세포 분석에 의해 중간엽 기질 세포의 마커와 일치하는 마커를 발현하는 이종 세포 집단을 일관되게 생?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Lab Animal Resources의 축산업에 감사를 표합니다. 이 원고의 자금 출처에는 Boettcher Fund, Murphy Turner Fund, CSU College of Veterinary Medicine 및 Biomedical Sciences College Research Council이 포함됩니다. 그림 2A, 그림 2C 및 그림 3A 는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.
Materials
| 0.25% Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| 5 mL serological pipets | Celltreat | 229005B | |
| 6-well tissue culture plates | Celltreat | 229106 | |
| 10 cm cell culture dishes | Peak Serum | PS-4002 | |
| 10 ml serological pipets | Celltreat | 229210 | |
| 15 mL conical tubes | Celltreat | 667015B | |
| 50 mL conical tubes | Celltreat | 667050B | |
| BV2 microglia cell line | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| Cell lifter | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| Crystal violet | Electron Microscopy Sciences | 12785 | |
| Dispase | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| Essential amino acids | Thermo Scientific | 11130051 | |
| Ethanol (100%) | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Peak Serum | PS-FB4 | Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory |
| Formaldehyde | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| Glass 10 mL serological pipet | Corning | 7077-10N | |
| Hank’s Balances Salt Solution | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| Hemocytometer/Neubauer Chamber | Daigger | HU-3100 | |
| High Glucose DMEM | Cytiva | SH30022.01 | |
| low glucose DMEM containing L-glutamine | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024.FS | |
| non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| Paraformaldehyde (16%) | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Penicillin/streptomycin/neomycin | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| Phosphate buffered saline | Cytiva | SH30256.01 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D Systems | 485-MI | |
| Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF | R&D Systems | 410-MT | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later. |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | Collagenase/Dispase mixture |
| Sterile, individually wrapped cotton swab | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm | Greiner Bio-One | 657641 |
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