תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן מתורבתים יחד עם גליה מעורבת ראשונית כדי להפחית דלקת הנגרמת על ידי פריונים
Summary
לתאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן (AdMSCs) יש תכונות אימונומודולטוריות חזקות השימושיות לטיפול במחלות הקשורות לדלקת. אנו מדגימים כיצד לבודד ולגדל בתרבית של AdMSCs ותאי גליה מעורבים ראשוניים, לעורר AdMSCs כדי לווסת גנים אנטי דלקתיים וגורמי גדילה, להעריך הגירה של AdMSCs, ותרבית משותפת של AdMSCs עם גליה מעורבת ראשונית נגועה בפריון.
Abstract
תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) הם רגולטורים רבי עוצמה של דלקת באמצעות ייצור ציטוקינים אנטי דלקתיים, כימוקינים וגורמי גדילה. תאים אלה מראים יכולת לווסת דלקת עצבית בהקשר של מחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת פריון והפרעות אחרות בקיפול שגוי של חלבונים. מחלות פריון יכולות להיות ספורדיות, נרכשות או גנטיות; הם יכולים לנבוע מקיפול שגוי וצבירה של חלבון פריון במוח. מחלות אלה הן תמיד קטלניות, ללא טיפולים זמינים.
אחד הסימנים המוקדמים ביותר למחלה הוא הפעלת אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה ודלקת קשורה, המתרחשת לפני צבירת פריונים הניתנים לגילוי ואובדן עצבי; לכן, תכונות אנטי דלקתיות רגולטוריות של MSCs ניתן לקצור לטיפול astrogliosis במחלת פריון. לאחרונה הראינו כי MSCs שמקורם בשומן (AdMSCs) בתרבית משותפת עם תאי BV2 או גליה מעורבת ראשונית מפחיתים דלקת הנגרמת על ידי פריונים באמצעות איתות פרקריני. מאמר זה מתאר טיפול אמין באמצעות AdMSCs מגורה כדי להפחית דלקת הנגרמת על ידי פריונים.
אוכלוסייה הטרוזיגוטית של AdMSCs יכולה בקלות להיות מבודדת מרקמת שומן מורין ולהרחיב בתרבית. גירוי תאים אלה עם ציטוקינים דלקתיים משפר את יכולתם גם לנדוד לכיוון הומוגנט מוחי נגוע פריונים וגם לייצר מודולטורים אנטי דלקתיים בתגובה. יחד, טכניקות אלה יכולות לשמש לחקר הפוטנציאל הטיפולי של MSCs על זיהום פריונים וניתן להתאים אותן לקיפול שגוי של חלבונים אחרים ולמחלות נוירו-דלקתיות.
Introduction
דלקת גליה ממלאת תפקיד מפתח במגוון מחלות נוירודגנרטיביות, כולל פרקינסון, אלצהיימר ומחלות פריונים. למרות שצבירה חריגה של חלבונים מיוחסת לחלק גדול מפתוגנזה של מחלות וניוון עצבי, תאי גליה גם ממלאים תפקיד בהחמרת 1,2,3 זה. לכן, התמקדות בדלקת הנגרמת על ידי גליה היא גישה טיפולית מבטיחה. במחלת פריונים, חלבון הפריון התאי (PrPC) מתקפל בטעות לחלבון פריון הקשור למחלה (PrPSc), היוצר אוליגומרים וצברים ומשבש את ההומאוסטזיס במוח 4,5,6.
אחד הסימנים המוקדמים ביותר למחלת פריונים הוא תגובה דלקתית של אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה. מחקרים המדכאים תגובה זו, בין אם על ידי הסרת מיקרוגליה או שינוי של אסטרוציטים, בדרך כלל לא הראו שיפור או החמרה בפתוגנזה של מחלות במודלים של בעלי חיים 7,8,9. ויסות דלקת גליה מבלי לחסל אותה היא חלופה מסקרנת כטיפול.
תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) עלו על הבמה כטיפול במגוון מחלות דלקתיות, בשל יכולתם לווסת דלקת באופן פרקריני 10,11. הם הראו יכולת לנדוד לאתרי דלקת ולהגיב למולקולות איתות בסביבות אלה על ידי הפרשת מולקולות אנטי דלקתיות, גורמי גדילה, מיקרו-רנ”א ועוד 10,12,13. הראינו בעבר כי MSCs שמקורם ברקמת השומן (מסומנים ב-AdMSCs) מסוגלים לנדוד לעבר הומוגנט מוחי נגוע בפריונים ולהגיב להומוגנט במוח זה על-ידי ויסות ביטוי גנים עבור ציטוקינים אנטי-דלקתיים וגורמי גדילה.
יתר על כן, AdMSCs יכולים להפחית את הביטוי של גנים הקשורים לגורם גרעיני-קאפה B (NF-κB), תחום הקולטן דמוי הנוד פירין המכיל 3 (NLRP3) איתות דלקתי, והפעלת גלייה, הן במיקרוגליה BV2 והן בגליה מעורבת ראשונית 14. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים כיצד לבודד הן AdMSCs והן גליה מעורבת ראשונית מעכברים, לעורר AdMSCs כדי לווסת גנים מודולטוריים, להעריך נדידת AdMSC, ותרבית משותפת AdMSCs עם גליה נגועה פריונים. אנו מקווים כי נהלים אלה יכולים לספק בסיס לחקירה נוספת של התפקיד של MSCs בוויסות דלקת הנגרמת על ידי גליה במחלות נוירודגנרטיביות ואחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מדגימים פרוטוקול אמין וזול יחסית להערכת ההשפעות של תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן (AdMSC) בהפחתת דלקת הנגרמת על ידי פריונים במודל תאי גלייה. ניתן בקלות לבודד ולהרחיב את AdMSCs בתרבית לשימוש תוך שבוע אחד בלבד. פרוטוקול זה מייצר באופן עקבי אוכלוסייה הטרולוגית של תאים המבטאים סמנים הת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ל-Lab Animal Resources על גידול בעלי החיים. מקורות המימון שלנו לכתב יד זה כוללים את קרן בוטצ’ר, קרן מרפי טרנר, מכללת CSU לרפואה וטרינרית ומועצת המחקר של המכללה למדעים ביו-רפואיים. איור 2A, איור 2C ואיור 3A נוצרו עם BioRender.com.
Materials
| 0.25% Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| 5 mL serological pipets | Celltreat | 229005B | |
| 6-well tissue culture plates | Celltreat | 229106 | |
| 10 cm cell culture dishes | Peak Serum | PS-4002 | |
| 10 ml serological pipets | Celltreat | 229210 | |
| 15 mL conical tubes | Celltreat | 667015B | |
| 50 mL conical tubes | Celltreat | 667050B | |
| BV2 microglia cell line | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| Cell lifter | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| Crystal violet | Electron Microscopy Sciences | 12785 | |
| Dispase | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| Essential amino acids | Thermo Scientific | 11130051 | |
| Ethanol (100%) | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Peak Serum | PS-FB4 | Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory |
| Formaldehyde | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| Glass 10 mL serological pipet | Corning | 7077-10N | |
| Hank’s Balances Salt Solution | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| Hemocytometer/Neubauer Chamber | Daigger | HU-3100 | |
| High Glucose DMEM | Cytiva | SH30022.01 | |
| low glucose DMEM containing L-glutamine | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024.FS | |
| non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| Paraformaldehyde (16%) | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Penicillin/streptomycin/neomycin | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| Phosphate buffered saline | Cytiva | SH30256.01 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D Systems | 485-MI | |
| Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF | R&D Systems | 410-MT | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later. |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | Collagenase/Dispase mixture |
| Sterile, individually wrapped cotton swab | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm | Greiner Bio-One | 657641 |
References
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
- Smith, H. L., et al. Astrocyte unfolded protein response induces a specific reactivity state that causes non-cell-autonomous neuronal degeneration. Neuron. 105 (5), 855-866 (2020).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Collinge, J., Clarke, A. R. A general model of prion strains and their pathogenicity. Science. 318 (5852), 930-936 (2007).
- Gajdusek, D. C. Transmissible and non-transmissible amyloidoses: autocatalytic post-translational conversion of host precursor proteins to beta-pleated sheet configurations. J Neuroimmunol. 20 (2-3), 95-110 (1988).
- Come, J. H., Fraser, P. E., Lansbury, P. T. A kinetic model for amyloid formation in the prion diseases: importance of seeding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (13), 5959-5963 (1993).
- Hartmann, K., et al. Complement 3(+)-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 83 (2019).
- Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Striebel, J., Chesebro, B. Microglia are critical in host defense against prion disease. Journal of Virology. 92 (15), e00549 (2018).
- Bradford, B. M., McGuire, L. I., Hume, D. A., Pridans, C., Mabbott, N. A. Microglia deficiency accelerates prion disease but does not enhance prion accumulation in the brain. Glia. 70 (11), 2169-2187 (2022).
- Li, M., Chen, H., Zhu, M. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine in central nervous system. Frontiers in Neuroscience. 16, 1068114 (2022).
- Sanchez-Castillo, A. I., et al. Switching roles: beneficial effects of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells on microglia and their implication in neurodegenerative diseases. Biomolecules. 12 (2), 219 (2022).
- Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), 784 (2019).
- Xiao, Q., et al. TNF-alpha increases bone marrow mesenchymal stem cell migration to ischemic tissues. Cell Biochemistry and Biophysics. 62 (3), 409-414 (2012).
- Hay, A. J. D., Murphy, T. J., Popichak, K. A., Zabel, M. D., Moreno, J. A. Adipose-derived mesenchymal stromal cells decrease prion-induced glial inflammation in vitro. Scientific Reports. 12 (1), 22567 (2022).
- Kirkley, K. S., Popichak, K. A., Afzali, M. F., Legare, M. E., Tjalkens, R. B. Microglia amplify inflammatory activation of astrocytes in manganese neurotoxicity. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 99 (2017).
- Popichak, K. A., Afzali, M. F., Kirkley, K. S., Tjalkens, R. B. Glial-neuronal signaling mechanisms underlying the neuroinflammatory effects of manganese. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 324 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hass, R., Otte, A. Mesenchymal stem cells as all-round supporters in a normal and neoplastic microenvironment. Cell Communication and Signaling: CCS. 10 (1), 26 (2012).
- Carroll, J. A., et al. Prion strain differences in accumulation of PrPSc on neurons and glia are associated with similar expression profiles of neuroinflammatory genes: comparison of three prion strains. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005551 (2016).
- Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Chesebro, B. Toll-like receptor 2 confers partial neuroprotection during prion disease. PLoS One. 13 (12), e0208559 (2018).
- Yu, Y., et al. Hypoxia and low-dose inflammatory stimulus synergistically enhance bone marrow mesenchymal stem cell migration. Cell Proliferation. 50 (1), e12309 (2017).
- Hay, A. J. D., et al. Intranasally delivered mesenchymal stromal cells decrease glial inflammation early in prion disease. Frontiers in Neuroscience. 17, 1158408 (2023).
- English, K., Barry, F. P., Field-Corbett, C. P., Mahon, B. P. IFN-gamma and TNF-alpha differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells. Immunology Letters. 110 (2), 91-100 (2007).
- Hemeda, H., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha differentially affect cytokine expression and migration properties of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 19 (5), 693-706 (2010).
- Carta, M., Aguzzi, A. Molecular foundations of prion strain diversity. Current Opinion in Neurobiology. 72, 22-31 (2022).
- Yu, F., et al. Phagocytic microglia and macrophages in brain injury and repair. CNS Neuroscience and Therapeutics. 28 (9), 1279-1293 (2022).
- Sinha, A., et al. Phagocytic activities of reactive microglia and astrocytes associated with prion diseases are dysregulated in opposite directions. Cells. 10 (7), 1728 (2021).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. Journal of Neuroinflammation. 9, 115 (2012).
- Shan, Z., et al. Therapeutic effect of autologous compact bone-derived mesenchymal stem cell transplantation on prion disease. Journal of General Virology. 98 (10), 2615-2627 (2017).
- Johnson, T. E., et al. Monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection. Journal of Visualized Experiments. (45), e2349 (2010).
- Liu, F., et al. MSC-secreted TGF-beta regulates lipopolysaccharide-stimulated macrophage M2-like polarization via the Akt/FoxO1 pathway. Stem Cell Research and Therapy. 10, 345 (2019).
