Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Emery L. Ng; Ashley L. Reed; Christopher B. O&#8217;Connell; Nathan N. Alder

doi:10.3791/65561

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

神经科学

Использование визуализации STED живых клеток для визуализации ультраструктуры внутренней мембраны митохондрий в моделях нейрональных клеток

Published: June 30, 2023

doi:

10.3791/65561

Emery L. Ng¹, Ashley L. Reed², Christopher B. O’Connell¹, Nathan N. Alder²

¹Center for Open Research Resources and Equipment,University of Connecticut, ²Department of Molecular and Cell Biology,University of Connecticut

Summary

Этот протокол представляет собой рабочий процесс для размножения, дифференцировки и окрашивания культивируемых клеток SH-SY5Y и первичных нейронов гиппокампа крысы для визуализации и анализа ультраструктуры митохондрий с использованием микроскопии истощения вынужденной эмиссии (STED).

Abstract

Митохондрии играют много важных ролей в клетке, включая производство энергии, регуляцию гомеостаза^Ca2+ , биосинтез липидов и производство активных форм кислорода (АФК). Эти митохондриальные опосредованные процессы берут на себя специализированные роли в нейронах, координируя аэробный метаболизм для удовлетворения высоких энергетических потребностей этих клеток, модулируя передачу сигналов Ca2⁺ , обеспечивая липиды для роста и регенерации аксонов и настраивая производство АФК для развития и функционирования нейронов. Таким образом, митохондриальная дисфункция является основным фактором нейродегенеративных заболеваний. Структура и функции митохондрий неразрывно связаны. Морфологически сложная внутренняя мембрана со структурными складками, называемыми кристами, содержит множество молекулярных систем, которые выполняют сигнатурные процессы митохондрии. Архитектурные особенности внутренней мембраны являются ультраструктурными и, следовательно, слишком малы, чтобы их можно было визуализировать с помощью традиционной дифракционно-ограниченной разрешающей микроскопии. Таким образом, большая часть информации о ультраструктуре митохондрий была получена с помощью электронной микроскопии на фиксированных образцах. Тем не менее, новые технологии флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения в настоящее время обеспечивают разрешение до десятков нанометров, что позволяет визуализировать ультраструктурные особенности живых клеток. Таким образом, визуализация со сверхвысоким разрешением предлагает беспрецедентную возможность прямого изображения мельчайших деталей митохондриальной структуры, наноразмерного распределения белков и динамики кристаллов, обеспечивая фундаментальные новые идеи, которые связывают митохондрии со здоровьем и болезнями человека. Этот протокол представляет собой использование микроскопии со сверхвысоким разрешением со стимулированным истощением эмиссии (STED) для визуализации митохондриальной ультраструктуры живых клеток нейробластомы человека и первичных нейронов крыс. Эта процедура состоит из пяти разделов: (1) рост и дифференцировка клеточной линии SH-SY5Y, (2) выделение, покрытие и рост первичных нейронов гиппокампа крысы, (3) процедуры окрашивания клеток для визуализации живых ЗППП, (4) процедуры экспериментов с живыми клетками, ЗППП с использованием микроскопа ЗПТП для справки, и (5) руководство по сегментации и обработке изображений с использованием примеров для измерения и количественной оценки морфологических особенностей внутренней мембраны.

Introduction

Митохондрии — это эукариотические органеллы эндосимбиотического происхождения, которые отвечают за регуляцию нескольких ключевых клеточных процессов, включая промежуточный метаболизм и производство АТФ, ионный гомеостаз, биосинтез липидов и запрограммированную гибель клеток (апоптоз). Эти органеллы топологически сложны и содержат двойную мембранную систему, которая образует несколько подкомпартментов 1 (рис. 1А). Наружная митохондриальная мембрана (ОММ) взаимодействует с цитозолью и устанавливает прямые межорганелльные контакты ^2,3. Внутренняя митохондриальная мембрана (МПМ) представляет собой энергосберегающую мембрану, которая поддерживает ионные градиенты, хранящиеся в основном в виде электрического мембранного потенциала (ΔΨ_m), для управления синтезом АТФ и другими энергоемкими процессами ^4,5. IMM далее подразделяется на внутреннюю пограничную мембрану (IBM), которая плотно прижата к OMM, и выступающие структуры, называемые кристами, которые связаны кристальной мембраной (CM). Эта мембрана отделяет самый внутренний матриксный отсек от внутрикристаллического пространства (ICS) и межмембранного пространства (IMS).

Митохондрии имеют динамическую морфологию, основанную на непрерывных и сбалансированных процессах деления и слияния, которые регулируются механоферментами динаминного надсемейства⁶. Слияние позволяет увеличить связность и формирование ретикулярных сетей, в то время как деление приводит к фрагментации митохондрий и позволяет удалять поврежденные митохондрии с помощью митофагии⁷. Морфология митохондрий варьируется в зависимости от типа ткани⁸ и стадии развития⁹ и регулируется таким образом, чтобы позволить клеткам адаптироваться к таким факторам, как энергетические потребности¹⁰^, ¹¹ и стрессоры¹². Стандартные морфометрические характеристики митохондрий, такие как степень образования сети (взаимосвязанная или фрагментированная), периметр, площадь, объем, длина (соотношение сторон), округлость и степень ветвления, могут быть измерены и количественно оценены с помощью стандартной оптической микроскопии, поскольку размеры этих признаков превышают дифракционный предел света (~200 нм)¹³.

Архитектура Cristae определяет внутреннюю структуру митохондрий (рис. 1B). Разнообразие морфологий крист можно разделить на плоские (пластинчатые или дискоидальные) или тубулярно-везикулярные¹⁴. Все кристы прикрепляются в IBM через трубчатые или щелевые структуры, называемые кристальными переходами (CJ), которые могут служить для отделения IMS от ICS и IBM от CM¹⁵. Морфология Cristae регулируется ключевыми белковыми комплексами IMM, включая (1) митохондриальный контактный сайт и организационную систему cristae (MICOS), которая находится в CJ и стабилизирует контакты IMM-OMM 16, (2) ГТФазу оптической атрофии 1 (OPA1), которая регулирует ремоделирование крист^17,18,19, и (3) F₁F_O АТФ-синтазу, которая образует стабилизирующие олигомерные сборки на концах кристаллов (CTs)²⁰^,²¹. См. Кроме того, IMM обогащен недвухслойными фосфолипидами, фосфатидилэтаноламином и кардиолипином, которые стабилизируют сильно изогнутый IMM²². Кристы также динамичны, демонстрируя морфологические изменения в различных условиях, таких как различные метаболические состояния 23,24, с различными респираторными субстратами 25, при голодании и окислительном стрессе 26,27, при апоптозе ^28,29 и при старении ³⁰. Недавно было показано, что кристы могут претерпевать крупные изменения в течение нескольких секунд, что подчеркивает их динамическую^{природу.} Некоторые характеристики крист могут быть количественно определены, в том числе размеры структур внутри отдельных крист (например, ширина CJ, длина и ширина кристы) и параметры, которые связывают отдельные кристы с другими структурами (например, расстояние между кристаллами и угол падения крист относительно ОММ)³². Эти количественно поддающиеся количественной оценке параметры cristae показывают прямую корреляцию с функцией. Например, степень производства митохондриальной АТФ положительно связана с обилием крист, количественно определяемым как плотность кристаллов или число крист, нормированное по другому признаку (например, кристы на площадь ОММ)^33,34,35. Поскольку морфология ИММ определяется наноразмерными особенностями, она включает в себя митохондриальную ультраструктуру, что требует методов визуализации, обеспечивающих разрешение, превышающее предел дифракции света. Как описано ниже, к таким методам относятся электронная микроскопия и микроскопия сверхвысокого разрешения (наноскопия).

Нервные и глиальные клетки центральной нервной системы (ЦНС) особенно зависят от функции митохондрий. В среднем, мозг составляет всего 2% от общей массы тела, но использует 25% общей глюкозы в организме и на его долю приходится 20% потребления кислорода организмом, что делает его уязвимым к нарушениям энергетического метаболизма^. Прогрессирующие нейродегенеративные заболевания (НД), включая болезнь Альцгеймера (БА), боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Хантингтона (БГ), рассеянный склероз (РС) и болезнь Паркинсона (БП), являются одними из наиболее широко изученных патологий на сегодняшний день, причем исследовательские усилия варьируются от понимания молекулярных основ этих заболеваний до поиска потенциальных терапевтических профилактики и вмешательств. НД связаны с повышенным окислительным стрессом, частично вызванным активными формами кислорода (АФК), генерируемыми митохондриальной цепью переноса электронов (ETC)³⁷, а также с изменением митохондриального кальциевого управления 38 и митохондриального липидного метаболизма³⁹. Эти физиологические изменения сопровождаются отмеченными дефектами морфологии митохондрий, которые связаны с AD 40,41,42,43,44, ALS^45,46, HD^47,48,49, MS⁵⁰ и PD ^51,52,53. Эти структурные и функциональные дефекты могут быть связаны сложными причинно-следственными связями. Например, учитывая, что морфология кристы стабилизирует ферменты OXPHOS⁵⁴, митохондриальные АФК не только генерируются ETC, но и повреждают инфраструктуру, в которой находится ETC, способствуя циклу прямых АФК, который повышает восприимчивость к окислительному повреждению. Кроме того, было показано, что дезорганизация крист запускает такие процессы, как высвобождение митохондриальной ДНК (мтДНК) и воспалительные пути, связанные с аутоиммунными, метаболическими и возрастными расстройствами. Таким образом, анализ митохондриальной структуры является ключом к полному пониманию НД и их молекулярных основ.

Популярные методы исследования крист, включая просвечивающую электронную микроскопию, электронную томографию и криоэлектронную томографию (крио-ЭТ), а также рентгеновскую томографию, в частности крио-мягкую рентгеновскую томографию, позволили получить важные результаты и работать с различными типами образцов 56,57,58,59,60 . Несмотря на недавние достижения в области лучшего наблюдения за ультраструктурой органелляров, эти методы по-прежнему имеют оговорку, требующую фиксации образца и, следовательно, не могут напрямую фиксировать динамику кристаллов в реальном времени. Флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения, особенно в формах микроскопии со структурированным освещением (SIM), стохастической оптической реконструктивной микроскопии (STORM), фотоактивированной локализованной микроскопии (PALM), расширительной микроскопии (ExM) и микроскопии с вынужденным эмиссионным истощением (STED), стали популярными способами просмотра структур, требующих разрешения ниже дифракционного предела, который ограничивает классические методы оптической микроскопии. При использовании ExM в сочетании с другим методом сверхвысокого разрешения результаты впечатляют, но образец должен быть зафиксирован и окрашен в гель⁶¹. Для сравнения, SIM, PALM/STORM и STED были успешно использованы с живыми образцами, а новые и перспективные красители, которые обычно окрашивают IMM, обеспечивают новый и простой подход к визуализации митохондрий cristae^dynamics 62,63,64,65,66. Недавние достижения в области живых красителей для визуализации ЗППП улучшили яркость и фотостабильность красителей, и эти красители нацелены на IMM с более высокой степенью специфичности, чем их предшественники. Эти разработки позволяют собирать долгосрочные эксперименты с таймлапсом и z-стеком с визуализацией сверхвысокого разрешения, открывая дверь для лучшего анализа ультраструктуры и динамики митохондриальных клеток в живых клетках.

В данной работе представлены протоколы визуализации живых клеток недифференцированных и дифференцированных клеток SH-SY5Y, окрашенных красителем PKmito Orange (PKMO) с использованием STED⁶³. Клеточная линия SH-SY5Y представляет собой трижды клонированное производное родительской клеточной линии SK-N-SH, полученное из биопсии костного мозга метастатической нейробластомы 67,68,69,70. Эта клеточная линия является широко используемой моделью in vitro в исследованиях НД, особенно при таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера, БГ и болезнь Паркинсона, в которых митохондриальная дисфункция в значительной степени вовлечена 10,43,71,72,73. Способность дифференцировать клетки SH-SY5Y в клетки с нейроноподобным фенотипом путем манипулирования питательными средами оказалась подходящей моделью для исследований в области неврологии, не полагаясь на первичные нейрональные клетки^10,74. В этом протоколе ретиноевая кислота (РА) добавлялась в питательную среду для клеточной культуры, чтобы индуцировать дифференцировку клеток SH-SY5Y. Ревматоидный артрит является производным витамина А и, как было показано, регулирует клеточный цикл и способствует экспрессии транскрипционных факторов, регулирующих дифференцировку нейронов⁷⁵. Также представлен протокол культивирования и визуализации живых клеток нейронов, выделенных из гиппокампа крысы. Было показано, что гиппокамп подвержен митохондриальной дегенерации и, наряду с корой головного мозга, играет важную роль в старении и ND 76,77,78,79,80.

Protocol

1. Размножение и дифференцировка клеток SH-SY5Y Подготовка среды для роста и поддержания клетокПриготовьте полноценную модифицированную орлиную среду Dulbecco с высоким содержанием глюкозы (DMEM, 4,5 г/л D-глюкозы, 4 мМ L-глютамина, 110 мг/л пирувата натрия) с добавлением 1% (v/v) антибиотика-антимикотика (10 000 ЕД/мл пенициллина, 10 000 мкг/мл стрептомицина и 25 мкг/мл амфотерицина B) и различных количеств фетальной бычьей сыворотки (FBS) (см. Таблицу материалов). Количество FBS в дифференцированных средах варьируется в пределах 10%, 5% или 2% (v/v) FBS. Обслуживание клетокПоддерживайте клетки в DMEM с добавлением 10% (v/v) FBS и помещайте их при 37 °C и 5% CO2, затем засевайте в DMEM с содержанием 5% (v/v) FBS для дифференцировки. Замороженные запасы клеток хранили в FBS с 10% (v/v) диметилсульфоксидом (ДМСО) в концентрации 1-2 x 107 клеток/мл. Приготовление ретиноевой кислоты (РА)Растворите 7,51 мг all-trans-RA (см. таблицу материалов) в 5 мл свежеприготовленного 95% этанола до получения 5 мМ исходного раствора. Проверяют концентрацию с абсорбцией при 350 нм (ɛ = 44 300 М-1 см-1), полученную из паспорта продукта из протокола производителя81, используя разбавление исходного раствора при 5 мкМ в этаноле. Храните 5 мМ в защищенном от света месте при температуре 4 °C до 6 недель. Приготовление поли-D-лизина для покрытия покровным покрытиемПРИМЕЧАНИЕ: Протокол поли-D-лизина (PDL), который можно найти в разделе «Документы и загрузки» на сайтепоставщика 82, содержит информацию о нанесении покрытий на различные сосуды для культивирования.Данный протокол включает в себя объемы на основе 2-луночного камерного сосуда площадью 4см2 на лунку со стерильным боросиликатным покровным дном #1,5 (см. таблицу материалов). Разбавьте исходный раствор PDL в два раза до 50 мкг/мл PBS Dulbecco (DPBS; без кальция и магния).ПРИМЕЧАНИЕ: Покровное стекло #1.5 или #1.5H является приемлемой толщиной, что имеет важное значение для качества изображения. Другие толщины вызывают сферическую аберрацию, и их следует избегать. Покрытие покровного стекла PDLПРИМЕЧАНИЕ: Покровные стекла можно подвергать воздействию ультрафиолетового (УФ) света в течение 10-15 минут в шкафу биобезопасности для дальнейшей стерилизации.Наносят по 1,2 мл раствора PDL 50 мкг/мл на каждую лунку стерильных камерных покровных стекол в шкафу для клеточных культур и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Удалите раствор PDL и трижды промойте 3,6 мл дистиллированной воды. После завершения окончательной стирки дайте камере с покрытием высохнуть в течение 2 часов на воздухе, прежде чем ополаскивать и использовать сразу или хранить в герметичном контейнере при температуре 4 °C до 2 недель.ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно промойте покровные стекла, так как избыток PDL может быть токсичным для клеток. Дифференцировка клеток SH-SY5Y с РАПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте ячейки выше прохода 15. Клетки проходят при слиянии 80%-90%. Процедуры дифференциации различаются, но следуют схожим этапам. Дополнительная дифференцировка от нейробластом к зрелым нейронам получена при дальнейшем лечении нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF)68,83,84,85, но в данном протоколе не проводилась.НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Установите ячейки не менее чем за 24 часа до посева на покровное стекло. Чтобы получить клетки из замороженных запасов, быстро разморозьте 1 мл замороженного флакона клеток и добавьте к 9 мл предварительно подогретой среды с добавлением 10% FBS, затем отжим при 350 x g в течение 10 мин (при комнатной температуре) и выбросьте надосадочную жидкость для удаления ДМСО. Повторно суспендируйте гранулы в 5 мл предварительно подогретой среды и семенные ячейки в колбе Т-25. Как только клетки достигнут 80%-90% слияния, пассажируйте клетки, подсчитывая и засевая их для дифференцировки, когда это применимо.День 0: Семенные клетки.Высевают клетки на камерное покровное стекло из замороженных запасов или рабочую колбу. Используйте плотность посева 1,5 x 104 клетки/см2.ПРИМЕЧАНИЕ: Для одной лунки в стандартном 2-луночном покровном стекле с площадью культивирования 4 см2 потребуется 6,0 x 104 ячейки. Клетки, которые останутся недифференцированными, должны быть засеяны DMEM с добавлением 10% (v/v) FBS, а клетки, которые будут дифференцированы, должны быть засеяны DMEM с добавлением 5% (v/v) FBS. День 1: Начать дифференцировку РА.Приготовьте DMEM с добавлением 5% (v/v) FBS, 1% (v/v) антибиотика-антимикотика и конечной концентрации 10 мкМ RA или этанола того же объема добавки, чтобы служить в качестве транспортного средства для этой процедуры дифференциации. Удалите фильтрующий материал из защитного стекла, используемого для посева, промойте 1x PBS и добавьте новый DMEM в лунки. День 3: Замените носитель свежим материалом, содержащим RA или этанол.Удалите среду с 1-го дня и замените свежей средой с добавлением 2% (v/v) FBS, 1% (v/v) антибиотик-антимикотик и либо 10 мкМ RA, либо 95% этанола того же объема добавки, чтобы служить в качестве средства контроля для этой процедуры дифференциации. Удалите фильтрующий материал из покровного стекла, используемого для посева, промойте 1x PBS и добавьте новую среду в лунки. День 6: Визуализация клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Время дифференцировки клеток варьируется в зависимости от протокола, но шести дней воздействия РА достаточно, чтобы индуцировать нейроноподобный фенотип в клетках SH-SY5Y86.Выполните визуализацию в реальном времени, подробности описаны в разделах 3 и 4 (рис. 2). 2. Первичная культура нейронов гиппокампа крыс Подготовка материалов для выделения нейронов гиппокампа крыс.Приготовьте свежий дополненный ДМЭМ.Отфильтруйте-стерилизуйте смесь DMEM (с высоким содержанием глюкозы, без пирувата натрия) с добавлением 10% (v/v) термоинактивированного FBS, 1% (v/v) раствора пирувата натрия и 1% (v/v) пенициллина-стрептомицина (10 000 Ед/мл). Хранить до 2 недель при температуре 4 °C. Приготовьте свежую питательную среду для роста нейронов.Отфильтруйте-стерилизуйте смесь питательных сред нейронов с добавлением 2% (v/v) добавки B27, 0,25% (v/v) добавки глутамина и 1% (v/v) пенициллина-стрептомицина (см. таблицу материалов). Хранить до 2 недель при температуре 4 °C. Подготавливают первичную культуру нейронов гиппокампа.Готовят первичную культуру нейронов гиппокампа в соответствии с ранее опубликованной работой87 и протоколом продукта на сайте производителя, из которого получен препарированный гиппокамп крысы Е1888 (см. таблицу материалов). Этот протокол приводит к тому, что популяция в основном нейронов содержит <2% астроцитов.ПРИМЕЧАНИЕ: Среда для гибернации, с которой поставляется эта ткань, будет использоваться для будущих этапов этого протокола. Не выбрасывайте его. Подготовьте материалы и среды для диссоциации тканей.Подожгите пипетку Пастера, чтобы уменьшить диаметр отверстия, и храните ее в фольге, чтобы предотвратить загрязнение до использования. Разогрейте подготовленный DMEM, 1X буферный солевой раствор Хэнка (HBSS) и питательную среду для нейронов до 37 °C. Добавьте 2 чешуйки ДНКазы стерильным пинцетом в коническую пробирку объемом 15 мл. Провести диссоциацию тканей.Удалите как можно больше гибернальной среды, в которой хранится препарированный гиппокамп крысы E18, прежде чем поместить ткань в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую ДНКазу, и провести непродолжительную инкубацию при 37 °C. Добавьте 900 мкл 1X HBSS, а затем 100 мкл 0,5% трипсина. Инкубируйте ткань при температуре 37 °C в течение 15 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Планшеты с покрытием PDL можно извлечь из хранилища и поместить в инкубатор до использования в течение этого инкубационного периода. Провести гомогенизацию тканей и подсчет клеток.После инкубации с трипсином удалите среду и добавьте в ткань 1 мл предварительно подогретой гибернированной среды-ДНКазы из предыдущего этапа и гомогенизируйте пипеткой Пастера. Среда будет выглядеть непрозрачной, а затем постепенно прозрачной по мере продолжения гомогенизации. Добавьте диссоциированные нейроны в новую пробирку с 4 мл предварительно подогретого DMEM, а затем подсчитайте количество клеток с помощью счетчика клеток. Выполнение покрытия клеток и выращивание первичных клеток.Пластинчатые ячейки с плотностью примерно 1,65 x 104 ячейки/см2 в DMEM. Для 2-луночного покровного стекла (4 см 2) высевают 65 000 – 70 000 клеток на лунку с2 мл DMEM. Инкубируют клетки при 37 °C и 5% CO 2 в течение2 ч перед проверкой на адгезию. Как только клетки начнут прилипать, удалите 1 мл среды и замените ее таким же объемом гибернированной среды, затем осторожно перемешайте, чтобы перемешать. После того, как среда будет смешана, повторите этот процесс и удалите половину присутствующей среды и замените тем же объемом среды для роста нейронов, затем осторожно перемешайте.ПРИМЕЧАНИЕ: Днем нанесения покрытия считается день in vitro (DIV) 0, а клетки готовы к изображению в DIV 7 (рис. 2). 3. Подготовка клеток к визуализации живых клеток ПРИМЕЧАНИЕ: Типы и происхождение клеток (т.е. культивируемые и первичные клетки) могут различаться по требованиям к окрашиванию; Подробнее см. опубликованные отчеты62,63. Приготовление PKmito OrangeПРИМЕЧАНИЕ: Другие красители, которые обычно окрашивают IMM, были зарегистрированыкак 64,65,66 и являются коммерчески доступными. PKMO является единственным, используемым в этом протоколе.Ресуспендировать порошок ПКМО (см. таблицу материалов) в ДМСО в соответствии с инструкциями изготовителя89. Отсасывайте среду из клеток и промывают в предварительно подогретых свободных от фенола средах. Перед окрашиванием клеток готовят запас ПКМО в предварительно подогретом ДМЭМ, не содержащем фенолового красного, с добавлением 2% (v/v) FBS или 10% (v/v) в зависимости от степени дифференцировки, HEPES до конечной концентрации 20 мМ и 1% (v/v) антибиотика-антимикотика перед окрашиванием клеток. Эта формула, без PKMO, представляет собой среду для визуализации живых клеток. Окрашивание клеток с помощью ПКМОИнкубируют клетки с красителем при температуре 37 °C и 5%CO2 в течение 30 мин. Промойте клетки трижды с помощью среды для визуализации живых клеток, а для окончательной промывки инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C, 5%CO2. Добавьте свежие, предварительно подогретые носители для визуализации живых клеток. Теперь клетки готовы к визуализации.ПРИМЕЧАНИЕ: Неотложные методы лечения (например, лекарственные препараты и/или стрессоры), если они используются, добавляются перед визуализацией в реальном времени; см. раздел «Обсуждение» и дополнительный рисунок 1. 4. Визуализация живых клеток с помощью STED-микроскопии ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется система STED, построенная на основе инвертированного микроскопа, с системой, указанной в таблице материалов. Эта система оснащена импульсными возбуждающими лазерами (лазер 561 нм с номинальной мощностью ~300 мкВт) и импульсным лазером истощения STED 775 нм (номинальная мощность 1,2 Вт), бесступенчато регулируемым гальваносканером и лавинным фотодиодным детектором (APD) на основе фильтра 615/20 нм. Здесь используется 100x/1.40 масляный иммерсионный объектив для STED. Для получения изображений используется программное обеспечение Lightbox. Все предоставленные детали имеют непосредственное отношение к данному программному обеспечению и настройке системы. Общие рекомендации и этапы визуализацииИспользуйте инкубатор или климатическую камеру для поддержания жизнеспособности клеток, но краткосрочные эксперименты при комнатной температуре также приемлемы. Эти шаги относятся к описанной выше настройке STED. Выберите набор лазеров и фильтров для визуализации.Используйте параметры для оранжевого красителя, выбрав краситель(и), используемый в окрашивании, из списка красителей или тот, у которого спектральные свойства наиболее близки к используемому красителю. Сделайте их активными, дважды щелкнув или перетащив их в список образцов, где написано «Перетащите сюда красители». Выберите регион для изображения.В обзоре создайте область интереса (ROI) вокруг интересующей митохондрии, выбрав прямоугольную кнопку ROI , щелкнув и перетащив ее, чтобы сформировать область. Размер ROI можно изменять и поворачивать с помощью углов ROI или изогнутых краев, которые появляются при наведении курсора мыши на угол.ПРИМЕЧАНИЕ: Сводку предлагаемых параметров визуализации можно найти в таблице 1. Эти параметры были эмпирически скорректированы с использованием ранее описанных параметров для этой установки STED и комбинации красителей63. Настройте стробирование.Рядом с меню « Общие » выберите меню « Стробирование » или нажмите и удерживайте, чтобы добавить меню в представление. Рекомендуется настроить стробирование детектора STED на длину от 1-1,05 до 7,8-7,85 нс, как показано здесь. Время стробирования может варьироваться и составлять от 1-1,05 до 7-7,05 нс. Отрегулируйте интенсивность соответствующим образом в соответствии с образцом.ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, мощность возбуждения, используемая для STED, в 2-3 раза превышает мощность, используемую для конфокального, поэтому образец, требующий 5% мощности возбуждающего лазера для конфокального сигнала, может использовать 10%-15% мощности возбуждающего лазера во время регистрации STED.Установите лазер возбуждения для STED на 15%-20% и лазер истощения STED на 20%-25% с накоплением 10 линий. Используйте время задержки пикселя 4 мкс при размере пикселя 20-25 нм. Точечное отверстие было сохранено на уровне 1,0 а.е. для культивируемых клеток и 0,7 а.е. для первичных клеток гиппокампа крысы, чтобы улучшить оптическое сечение в более плотно упакованных митохондриях.ПРИМЕЧАНИЕ: Для параллельного сравнения могут быть получены как конфокальные изображения, так и изображения STED (Рисунок 3A, B, Рисунок 4A) или только STED. Дополнительная информация о временных рядах/z-серияхВыберите временной ряд.Выберите раскрывающееся меню Время. Определите количество итераций (здесь используется 5) и интервал времени (здесь используется 25 или 30 с), желаемый для таймлапса (рис. 3C, D, рис. 4B).ПРИМЕЧАНИЕ: Если интервал короче, чем время сбора, итерации будут продолжаться без какой-либо задержки. При выполнении таймлапса настоятельно рекомендуется использовать идеальный блок фокусировки или аналогичное отслеживание фокусировки, чтобы избежать потенциального дрейфа. Установите диапазон громкости.Установите диапазон z-объема по желанию, включив опцию Volume и отрегулировав два конца диапазона. Размеры шага, используемые в этом протоколе для 2D-визуализации, составляли 150-200 нм. Рекомендуемый размер шага по отношению к выборке по Найквисту, необходимый для деконволюции сырого STED, может быть рассчитан с помощью онлайн-инструментов90.ПРИМЕЧАНИЕ: Мощность лазера истощения STED и количество отображаемых плоскостей могут увеличить фотообесцвечивание красителя и воздействие света на клетку до вредных уровней. Проверьте наличие признаков фототоксичности и фотоповреждений после приобретения. 5. Инструменты обработки и анализа ультраструктуры митохондрий ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка изображений (т.е. деконволюция) не является обязательной, но обычно используется при создании и анализе изображений STED для публикации. Деконволюция для улучшения контраста и уменьшения шума настоятельно рекомендуется для оптимальной сегментации отдельных крист, как описано ниже (рис. 2). Деконволюция изображения STEDПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение, используемое для деконволюции в этом протоколе, приведено в таблице материалов.Задайте микроскопические параметры изображения.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что метаданные микроскопа правильно введены в поле «Параметры микроскопа» изображения. К ним относятся показатель преломления монтажной среды; иммерсионная среда; размер пикселя; длины волн возбуждения, излучения и истощения; и любую другую соответствующую информацию. Шаблоны с этими параметрами можно сохранить для повторного использования. Деконволютивные необработанные изображения STED с помощью программного алгоритма.Доступ к автоматизированным алгоритмам деконволюции в программном обеспечении для деконволюции позволяет выполнять деконволюционную обработку изображений без участия оператора. Нажмите кнопку «Экспресс» и установите тип деконволюции на «Быстрая», «Стандартная», «Агрессивная» или «Консервативная» для различных степеней мощности деконволюции. Показаны репрезентативные изображения, использующие экспресс-деконволюцию с агрессивными настройками (рис. 3, рис. 4 и рис. 5). Сохраните изображения из программы деконволюции в формате ICS2. Для ручной деконволюции выполните следующие действия.Вкратце, при выполнении ручной деконволюции сохраняйте шаблоны мастера деконволюции для единообразия и имейте возможность загрузить шаблон при запуске мастера. Используйте информацию о функции распределения измеренных точек (PSF), если она сгенерирована с настройками и параметрами сбора. При необходимости обрежьте необработанное изображение STED, прежде чем программное обеспечение деконволюции автоматически стабилизирует изображение. Дополнения к программным пакетам деконволюции позволяют компенсировать возможные артефакты изображения, такие как тепловой дрейф и хроматические аберрации. Затем сгенерируйте логарифмическую гистограмму для ручного или автоматического выполнения вычитания фона. Выберите классический алгоритм деконволюции оценки максимального правдоподобия (CMLE).ПРИМЕЧАНИЕ: Для деконволюции ключевыми значениями для настройки являются порог отношения сигнал/шум, количество итераций и порог качества. Эти значения можно настроить, а деконволюцию можно предварительно просмотреть для определения оптимальных настроек. Сегментация и анализ частицПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует FIJI (Is Just ImageJ), программное обеспечение с открытым исходным кодом (см. Содержание материалов) для сегментации и анализа. Для этих целей доступно другое аналогичное программное обеспечение, включая CellProfiler, Icy, Ilastik и QuPath.Подготовьте изображения для сегментации.Откройте необработанные изображения STED .obf или файлы .ics2 из программного обеспечения деконволюции, перейдя в меню File → Open или щелкнув и перетащив файлы на панель инструментов ImageJ. Отсюда любая обработка, облегчающая сегментацию изображений, может быть выполнена до сегментации. Чтобы сохранить согласованность изменений, записывайте функции с помощью Плагины → Макросы → Запись, а также копируйте и вставляйте ключевые команды в новый макрос из Плагины → Новый → Макрос. Перед запуском макроса убедитесь, что выбрано изображение для обработки.ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно приемлемые изменения для количественного определения размера и формы включают обрезку, проецирование z-стека и вычитание фона с отключенным сглаживанием. Изменения должны выполняться согласованно между изображениями в наборе данных и сообщаться. Настройка обучаемых параметров сегментации WekaПРИМЕЧАНИЕ: Опубликована дополнительная информация с пошаговыми инструкциями по использованию полуавтоматического инструмента сегментации и последующего анализа митохондрий.Откройте деконволютированные изображения STED в подключаемом модуле Trainable Weka Segmentation (TWS)92 , расположенном в разделе Plugins → Segmentation → Trainable Weka Segmentation. В настройках сегментации выберите функции Размытие по Гауссу, Мембранные проекции и Фильтр Собеля . Толщина мембраны по умолчанию равна 1, а размер участка мембраны по умолчанию равен 19. Обозначьте класс 1 или 2 как “Cristae”, а другой как “Background” (рисунок 2). Модели также можно сохранить с помощью кнопки Сохранить классификатор . Выберите Загрузить классификатор , чтобы повторно использовать эти настройки для других изображений. Выполнение трассировки классов TWS.Используйте инструмент «Линия» или другие фигуры, чтобы выделить некоторые кристы или фон. По крайней мере, некоторые фоновые выделения должны включать пробелы между кристами. Нарисуйте линию над структурой, чтобы присвоить ее любому классу, затем нажмите кнопку «Добавить в » справа для cristae или background. Дважды щелкните трассировку, чтобы удалить структуру из этой метки. Обучение классификации TWS.Нажмите кнопку Обучить классификатор слева, чтобы создать карту на основе информации, предоставленной плагину. Наложение сегментированных классов можно включать и выключать с помощью кнопки Toggle Overlay , а непрозрачность наложения можно настроить в Настройках. Классификатор можно переобучить с помощью дополнительных меток. Когда все будет удовлетворено, нажмите кнопку «Получить вероятность ». Измерьте частицы.Используя карту вероятностей cristae, установите пороговое значение изображения, чтобы создать маску, а затем перейдите в Анализ → Анализ частиц. Как правило, можно использовать тип порога по умолчанию и настроить диапазон, чтобы обеспечить учет всех крист. Измерения, полученные при анализе частиц, можно настроить с помощью параметров Анализ → Установить измерения.ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры параметров размера и формы, таких как площадь, периметр, округлость и соотношение сторон крист, измеряются и отображаются на основе выбранных измерений (Рисунок 2, Рисунок 5A, Дополнительная таблица 1). НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Выберите необработанное изображение STED с теми же размерами, что и деконволютированное изображение, и примените ROI из менеджера, а затем выберите Измерить в диспетчере ROI, чтобы получить значения интенсивности. Получение линейных графиков.Линейные графики были построены на основе деконволюционных изображений STED. Нарисуйте многоточечную линию, отрегулируйте толщину линии до нескольких пикселей в ширину, чтобы усреднить шум, и станцуйте линию, чтобы она соответствовала митохондриям (рис. 2, рис. 5B). Полученный линейный график используется для измерения расстояний от пика до пика, чтобы сообщить о периодичности и распределении крист в определенном диапазоне.Примечание: В связи с этим, плотность крист может быть представлена как количество независимых крист в пределах данной области, определяемое путем измерения внешней части митохондрий. Митохондриальную площадь можно определить, применив фильтр к деконволюционному или необработанному изображению STED для создания маски. Убедитесь, что маска точно соответствует контуру митохондрий, прежде чем измерять площадь.

Representative Results

Этот протокол описывает условия роста культивируемых и первичных клеток с акцентом на визуализацию ЗППП живых клеток и последующий анализ митохондриальных крист. Проекции, сделанные с помощью ImageJ митохондрий из недифференцированных клеток SH-SY5Y (рис. 3A) и RA-дифференцированных клеток SH-SY5Y (рис. 3B), могут быть собраны в виде z-стеков с традиционными конфокальными и STED, а затем необработанные изображения STED могут быть деконволютированы. Также может быть выполнена таймлапс-визуализация, которая впоследствии деконволюционируется (рис. 3C, D). Используя несколько отличающиеся параметры визуализации для первичных нейронов гиппокампа крысы (Таблица 1), конфокальные и необработанные изображения ЗППП могут быть получены в виде z-стеков, а необработанные изображения ЗППП могут быть деконволютированы (Рисунок 4А). Также возможна таймлапс-визуализация митохондрий первичных нейронов (рис. 4B). В целом, интервальные изображения должны быть способны отображать митохондриальные динамические события. Когда необработанные и деконволютированные проекции z-стека STED из выборок, используемых для сегментации, кажутся согласованными, выполняются количественные измерения. Плагин TWS использует деконволютированное изображение STED для сегментации для создания вероятностной маски, которая затем используется для создания бинарной маски крист для получения параметров размера и формы (рисунок 5A). Области из этой маски сохраняются в диспетчере ROI и при необходимости могут быть применены к необработанному изображению STED для измерения различий в относительной интенсивности. Деконволютированные проекции STED также могут быть использованы для определения периодичности и плотности кристаллов в заданной области (рис. 5B). Рисунок 1: Морфология митохондрий. Митохондрии имеют двухмембранную систему, которая определяет различные подкомпартменты (А). Кристы представляют собой складки внутренней мембраны с определенными особенностями (B). Сокращения: ОММ, наружная митохондриальная мембрана; ICS, внутрикристаллическое пространство; IMS, межмембранное пространство; CM, кристальная мембрана; IBM, внутренняя граничная мембрана; МПМ, внутренняя митохондриальная мембрана; CT, кристальный наконечник; CJ, cristae junction. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Схема рабочего процесса. Клетки SH-SY5Y или первичные нейроны гиппокампа крысы выращивают на покровном стекле, покрытом PDL. Клетки SH-SY5Y выращиваются параллельно, чтобы оставаться недифференцированными или подвергаться дифференцировке РА в течение шести дней. Первичные нейроны гиппокампа крыс выращивали на покрытом PDL покровном стекле после того, как они были изолированы от срезов гиппокампа в течение семи дней. После того, как клетки были готовы к визуализации, их окрашивали PKMO и визуализировали STED. Затем необработанные изображения STED деконволюционируются, а деконволюционные изображения обрабатываются в FIJI для получения измерений размера и формы, таких как кристальная плотность, площадь, периметр, округлость и соотношение сторон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Визуализация митохондрий в клетках SH-SY5Y. Показаны репрезентативные конфокальные (слева), необработанные STED (в центре) и деконволюционные проекции изображений STED (справа) митохондрий из недифференцированных (A) и RA-дифференцированных (B) клеток SH-SY5Y с окрашиванием PKMO. Показан таймлапс с интервалами 30 с и 5 итерациями RA-дифференцированных клеток SH-SY5Y (C) с расширенными (D) выделенными областями (белыми прямоугольниками) с использованием масштабированных изображений этих областей без интерполяции. Масштабные линейки: A,B, 250 нм; C,D, 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Визуализация митохондрий в первичных нейронах гиппокампа крысы. На рисунке показаны репрезентативные конфокальные (слева), необработанные STED (в центре) и деконволюционные STED-проекции Гюйгенса (справа) на митохондрии первичных нейронов гиппокампа крыс (A). Показан таймлапс с интервалом 25 с и 5 итерациями митохондрий в этих нейронах (B). Масштабные линейки: А, 250 нм; B , 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Обработка деконволютированных STED-изображений в ImageJ. Показано репрезентативное использование плагина Trainable Weka Segmentation для измерения размера и формы кристы (A). Слева направо показаны следующие изображения: деконволюрированное изображение STED, карта вероятностей, основанная на сегментации из плагина TWS, маска из порогового значения в FIJI с использованием карты вероятностей в качестве входных данных, маска с очерченными ROI и ROI, наложенные на исходное деконволютированное изображение STED. Результирующие измерения площади, периметра, окружности и соотношения сторон, соответствующие этим объектам, можно найти в Дополнительной таблице 1. На рисунке показан линейный график с использованием деконволютированного изображения STED для измерения расстояний от пика до пика в качестве считывания плотности кристы (B). Масштабные линейки: 0,5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Размер пикселя (нм) Время выдержки (мкс) Линейный акк. Возбуждение 561 нм при регистрации STED (%) 775 нм Мощность истощения STED (%) Размер шага (нм) Точечное отверстие (AU) Интервал таймлапса (с) Итерации таймлапса Недифференциальный SH-SY5Y 20 4 10 15 20 200 1.0 30 5 RA-Дифференциированный SH-SY5Y 20-25 4 10-12 15 20-22 150-200 1.0 30 5 Первичные нейроны 20-25 4 10 10 25 200 0.7 30 5 ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пикселя может варьироваться в зависимости от требований к изображению и намерения деконволюции изображений. Для деконволюции требуется надлежащий отбор проб. Размер пикселя для необработанных изображений STED без деконволюции может достигать 30 нм. Таблица 1: Сводные параметры сбора STED. Отображаются настройки, используемые для 2D-визуализации STED для каждого типа клеток: недифференцированного SH-SY5Y, RA-дифференцированного SH-SY5Y и первичных нейронов гиппокампа крысы. Для всех таймлапсов было выполнено 5 итераций с различными интервалами в зависимости от размера ROI. Дополнительный рисунок 1: Визуализация клеток SH-SY5Y с добавлением амилоид-β (Aβ). На рисунке показаны репрезентативные конфокальные (слева), необработанные (в центре) и деконволюционные изображения STED (справа) RA-дифференцированных клеток SH-SY5Y с окрашиванием PKMO (вверху) и Aβ-HiLyte647 (внизу) (A). Показаны объединенные проекции z-стека необработанного PKMO STED (зеленый) с необработанным Aβ STED (пурпурный) (B) или деконволюционного PKMO STED (зеленый) с деконволюционным Aβ STED (пурпурный) (C). Масштабные линейки: 0,5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительная таблица 1: Размеры и форма сегментированных крист. Показаны размеры и формы площади (мкм2), периметра (мкм), округлости и соотношения сторон, соответствующие объектам, изображенным на рисунке 5А из сегментированных митохондрий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительная таблица 2: Сводные параметры сбора данных с образцами β амилоида. Отображаются настройки, используемые для 2D-визуализации PKMO и Aβ-HiLyte647 в недифференцированных и RA-дифференцированных клетках SH-SY5Y. Конфокальный Aβ-HiLyte647 может быть использован отдельно, так как не существует специфической структуры, которую нужно разрешить; Здесь показаны STED-изображения Aβ-HiLyte647 для частиц меньшего размера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 1: Протокол лечения амилоидной β. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

В этом протоколе представлено использование клеточной линии нейробластомы человека SH-SY5Y и первичных нейронов гиппокампа крысы с новым красителем PKMO, нацеленным на IMM, для визуализации живых клеток ЗППП. Из-за новизны PKMO, в настоящее время мало публикаций об использовании этого красителя для визуализации ЗППП в реальном времени. Использование этих типов клеток для визуализации ЗППП сопряжено с определенными трудностями, в частности, потому, что нейрональные клетки имеют более узкие митохондрии. Одним из ограничений этого протокола является используемый краситель PKMO, так как он может быть токсичен для клеток. Различные клетки и клеточные линии по-разному реагируют на краситель, поэтому может потребоваться корректировка концентрации красителя и времени инкубации для оптимизации результатов для получения сильного сигнала без вреда для клеток. Предлагаемое решение заключается в снижении концентрации и увеличении времени окрашивания⁶³; Однако это может привести к ухудшению окрашивания, не увеличивая жизнеспособность клеток.

Как и PKMO, коммерческий краситель Live Orange mito (Таблица материалов) также проявляет некоторую токсичность для клеток. Этот краситель был использован для различных культивируемых клеток, но не смог успешно продемонстрировать сопоставимое окрашивание в RA-дифференцированных клетках SH-SY5Y с теми же параметрами, что и их недифференцированные аналоги (наши неопубликованные наблюдения). Тем не менее, протоколы окрашивания могут быть оптимизированы для этого зонда и выбранных типов клеток. Для этого красителя использовалось время стробирования детектора от 1-1,05 до 7-7,05 нс, при этом все остальные параметры, указанные в таблице 1 , оставались прежними. Как правило, окрашивание клеток 200-250 нМ живым оранжевым мито в течение 45 мин давало результаты, сопоставимые с результатами ПКМО. Окрашивание с более высокой концентрацией в течение меньшего времени или окрашивание с более низкой концентрацией в течение того же периода времени или немного дольше может дать различные результаты и может быть благоприятным для других типов клеток или условий роста.

Визуализация первичных нейронов гиппокампа крыс отличается от иммортализированных клеток из-за природы проекций аксона и дендритов, а также распределения митохондрий во время визуализации. Одна из сложностей в этой части протокола заключается в том, что плотность посева определяет, смогут ли первичные культуры прижиться и расти здоровыми, а при более высоких плотностях проекции имеют тенденцию зарастать к DIV 10. Таким образом, митохондрии, полученные из этих первичных нейронов, скорее всего, будут поступать из тела клетки, а не из проекций; Тем не менее, успешный рост при более низкой начальной плотности клеток дает лучшие результаты визуализации в более поздние периоды роста. Ключевым моментом является обеспечение низкого фона и расфокусированного света, чтобы получить наилучшую контрастность для STED. Чтобы решить проблемы, связанные с клеточной популяцией, культивирование первичных клеток гиппокампа в питательной среде нейронов с добавлением B27 предотвращает рост глиальных клеток, и источник сообщает, что <5% клеток являются астроцитами, а отсутствие добавки NbActiv1 в питательной среде снижает количество астроцитов в культурах до <2%⁸⁷. Как для культивируемых клеток SH-SY5Y, так и для первичных нейронов гиппокампа крысы, покрытие PDL, используемое для роста, способствует фоновому помутнению на изображениях. Достаточное соотношение сигнал/шум достигается с помощью настроек, указанных в таблице 1, а деконволюция удаляет большую часть наблюдаемого фона.

В дополнение к визуализации, описанной здесь, также можно добавить лечение или стресс для клеток до или во время визуализации. Например, добавление трет-бутиловой перекиси водорода (tBHP) вызывает окислительный стресс, и можно отслеживать изменения в митохондриях с течением времени после добавления. Добавление амилоид-β (Aβ) с флуоресцентной меткой позволяет отслеживать распределение этого пептида по отношению к митохондриям, а также митохондриальную структуру с течением времени. Здоровье митохондрий в значительной степени связано с болезнью Альцгеймера, и широко доказано, что оно играет роль в токсичности Aβ ^43,71,72. Примечательно, что статус дифференцировки клеток SH-SY5Y влияет на локализацию предшественника белка Aβ (AβPP)⁸⁵, и эксперименты с использованием AβPP должны быть тщательно построены.

В качестве примера того, как этот протокол может быть адаптирован, показано, что флуоресцентный вариант Aβ(1-42)-HiLyte 647 может быть добавлен к клеткам, окрашенным PKMO, за 15 минут до визуализации (дополнительный рисунок 1). Параметры визуализации аналогичны (Дополнительная таблица 2), с основным отличием в том, что при визуализации более узких митохондрий требуется меньшее отверстие. Визуализация Aβ-HiLyte647 с STED требует меньшего общего возбуждения (6%-8%) и истощения STED (10%-12%) мощности лазера и меньшего количества накоплений (шесть). Стробирование детектора также увеличено с 0,1 до 10 нс. Несмотря на то, что разрешение STED Aβ не является обязательным, общее отношение сигнал/шум и размер частиц Aβ в необработанном STED были лучше, чем у конфокальных изображений, и последующая деконволюция также может быть выполнена. Сбор изображений STED и деконволюция необработанных проекций STED z-stack Aβ представляется особенно полезным при объединении с необработанными изображениями STED или деконволюционными изображениями STED пятна PKMO (дополнительный рисунок 1B, C). Оба канала были собраны с шагом одного кадра. Измерения зависящей от времени локализации, аналогичные тем, которые перечислены на рисунке 2 и показаны на рисунке 5, где это применимо, и различия в архитектуре кристаллов могут быть получены после стрессовой обработки или других дополнений.

Другие возможные методы двойного мечения в живых клетках митохондрий, о которых здесь не сообщается, но о которых сообщалось другими, включают использование SNAP-меченых белков⁹³, гало-меченных белков и использование других проницаемых для клеток красителей с генерическими мишенями, такими как мтДНК⁶³. Примечательно, что стратегия мечения SNAP и Halo влияет на результирующую интенсивность и продолжительность флуоресцентного сигнала при визуализации⁹⁴. Кроме того, несмотря на то, что в этом протоколе представлено несколько примеров анализа, который может быть применен к сегментированным митохондриям, существует множество других анализов, которые программные пакеты могут выполнять с этими изображениями.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Первичные нейроны гиппокампа крыс были предоставлены доктором Джорджем Ликотрафитисом и Шиджу Гу из Департамента биомедицинской инженерии Университета Коннектикута (Сторрс, Коннектикут, США). Прибор Abberior STED, размещенный в Центре передовой световой микроскопии в Центре открытых исследовательских ресурсов и оборудования, был приобретен на грант NIH S10OD023618 присужден Кристоферу О’Коннеллу. Это исследование было профинансировано грантом NIH R01AG065879 присуждено Натану Н. Алдеру.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300054
0.4% Trypan blue	Invitrogen	T10282
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red	Gibco	15400054
100 X antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens	Olympus		Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4
All-trans-retinoic acid	Sigma	R2625
Amyloid-β (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)	AnaSpec	AS-64161	Other fluorescent conjugates available
B27 supplement (50 X), serum free	Gibco	17504044
Cell Counter (Countess II FL)	Life Technologies	AMQAF1000
Centrifuge	Eppendorf	5804-R
Counter slides	Invitrogen	C10283
Conical tubes (15 mL)	Thermo Fisher Scientific	339650
Cuvettes (Quartz Cells)	Starna Cells, Inc.	9-Q-10	Used with Spectrometer as described in Section 1.3
DMEM (high glucose with sodium pyruvate)	Gibco	11995073	Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1
DMEM (high glucose no sodium pyruvate)	Gibco	11965092	Used for primary cell materials as described in Section 2
DMEM (phenol red-free)	Gibco	31053028	Used for imaging as described in Section 3
DMSO	Sigma	D8418
DNAase I from bovine pancreas	Sigma	DN25	Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2
DPBS (no calcium, no magnesium)	Gibco	14190144
E18 Rat Hippocampus	Transnetyx Tissue	SDEHP
Ethanol (200 proof)	Fisher Bioreagents	BP28184
Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated	Gibco	26140079	For cultured cells, in Section 1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Gibco	10082147	For primary cell culture, Section 2
Filter sterilization unit (0.1 µm, 500 mL)	Thermo Fisher Scientific	5660010
FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in	—	—	Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text
GlutaMAX supplement (100 X)	Gibco	35050061	Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2
Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers	Hausser Scientific	267110
HBSS (no calcium, no magnesium)	Gibco	14170120	Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2
HEPES	Gibco	15630080
Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10)	Scientific Volume Imaging (SVI)	—	The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5
IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus	Olympus	—	This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4
Lightbox software (V. 16.3.16118)	Abberior	—	Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4
Live Orange Mito dye	Abberior	LVORANGE-0146-30NMOL	Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion
Neurobasal media	Gibco	21103049	Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2
Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass	Nunc	155379	Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5
Pasteur Pipets (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	22183632
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
PKmito Orange dye	Spirochrome	SC053
Poly-D-lysine	Gibco	A3890401
SH-SY5Y Cell line	ATCC	CRL2266
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360070	Used for primary cell materials described in Section 2
Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis)	Thermo Fisher Scientific	840309000
STED Expert Line microscope	Abberior	—	STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior’s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol
T25 flask (TC-treated, filter cap)	Thermo Fisher Scientific	156367	Other culture vessels and sizes available

References

Iovine, J. C., Claypool, S. M., Alder, N. N. Mitochondrial compartmentalization: emerging themes in structure and function. Trends in Biochemical Sciences. 46 (11), 902-917 (2021).
Gupta, A., Becker, T. Mechanisms and pathways of mitochondrial outer membrane protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1862 (1), 148323 (2021).
Gordaliza-Alaguero, I., Cantó, C., Zorzano, A. Metabolic implications of organelle-mitochondria communication. EMBO Reports. 20 (9), e47928 (2019).
Klecker, T., Westermann, B. Pathways shaping the mitochondrial inner membrane. Open Biology. 11 (12), 210238 (2021).
Navarro, A., Boveris, A. The mitochondrial energy transduction system and the aging process. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (2), C670-C686 (2007).
Yu, R., Lendahl, U., Nistér, M., Zhao, J. Regulation of mammalian mitochondrial dynamics: opportunities and challenges. Frontiers in Endocrinology. 11, 374 (2020).
Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. The Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154 (2020).
Glancy, B., Kim, Y., Katti, P., Willingham, T. B. The functional impact of mitochondrial structure across subcellular scales. Frontiers in Physiology. 11, 541040 (2020).
Bahat, A., et al. MTCH2-mediated mitochondrial fusion drives exit from naïve pluripotency in embryonic stem cells. Nature Communications. 9 (1), 5132 (2018).
Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial fusion/fission dynamics in neurodegeneration and neuronal plasticity. Neurobiology of Disease. 90, 3-19 (2016).
Zemirli, N., Morel, E., Molino, D. Mitochondrial dynamics in basal and stressful conditions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 564 (2018).
Harwig, M. C., et al. Methods for imaging mammalian mitochondrial morphology: a prospective on mitograph. Analytical Biochemistry. 552, 81-99 (2018).
Pánek, T., Eliáš, M., Vancová, M., Lukeš, J., Hashimi, H. Returning to the fold for lessons in mitochondrial crista diversity and evolution. Current Biology. 30 (10), R575-R588 (2020).
Gottschalk, B., Madreiter-Sokolowski, C. T., Graier, W. F. Cristae junction as a fundamental switchboard for mitochondrial ion signaling and bioenergetics. Cell Calcium. 101, 102517 (2022).
Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
Frezza, C., et al. OPA1 controls apoptotic cristae remodeling independently from mitochondrial fusion. Cell. 126 (1), 177-189 (2006).
Meeusen, S., et al. Mitochondrial inner-membrane fusion and crista maintenance requires the dynamin-related GTPase Mgm1. Cell. 127 (2), 383-395 (2006).
Patten, D. A., et al. OPA1-dependent cristae modulation is essential for cellular adaptation to metabolic demand. The EMBO Journal. 33 (22), 2676-2691 (2014).
Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. The EMBO Journal. 21 (3), 221-230 (2002).
Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).
Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of nonbilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of Cell Biology. 30 (2), 269-297 (1966).
Dlasková, A., et al. Mitochondrial cristae narrowing upon higher 2-oxoglutarate load. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1860 (8), 659-678 (2019).
Pérez-Hernández, C. A., et al. Mitochondrial ultrastructure and activity are differentially regulated by glycolysis-, krebs cycle-, and microbiota-derived metabolites in monocytes. 生物学. 11 (8), 1132 (2022).
Mannella, C. A. Structural diversity of mitochondria: functional implications. Annals of the New York Academy of Sciences. 1147, 171-179 (2008).
Plecitá-Hlavatá, L., Ježek, P. Integration of superoxide formation and cristae morphology for mitochondrial redox signaling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 31-50 (2016).
Scorrano, L., et al. A distinct pathway remodels mitochondrial cristae and mobilizes cytochrome c during apoptosis. Developmental Cell. 2 (1), 55-67 (2002).
Heath-Engel, H. M., Shore, G. C. Mitochondrial membrane dynamics, cristae remodelling and apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 549-560 (2006).
Brandt, T., et al. Changes of mitochondrial ultrastructure and function during ageing in mice and Drosophilia. eLife. 6, e24662 (2017).
Kondadi, A. K., et al. Cristae undergo continuous cycles of membrane remodelling in a MICOS-dependent manner. EMBO Reports. 21, e49776 (2020).
Quintana-Cabrera, R., Mehrotra, A., Rigoni, G., Soriano, M. E. Who and how in the regulation of mitochondrial cristae shape and function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 94-101 (2018).
Nielsen, J., et al. Plasticity in mitochondrial cristae density allows metabolic capacity modulation in human skeletal muscle: Enlarged mitochondrial cristae density in athletes. The Journal of Physiology. 595 (9), 2839-2847 (2017).
Afzal, N., Lederer, W. J., Jafri, M. S., Mannella, C. A. Effect of crista morphology on mitochondrial ATP output: A computational study. Current Research in Physiology. 4, 163-176 (2021).
Heine, K. B., Parry, H. A., Hood, W. R. How does density of the inner mitochondrial membrane influence mitochondrial performance. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (2), R242-R248 (2023).
Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30 (2020).
Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: a key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24, 1583 (2019).
Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695 (2021).
Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
Petersen, C. A. H., et al. The amyloid beta-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (35), 13145-13150 (2008).
Gan, X., et al. Inhibition of ERK-DLP1 signaling and mitochondrial division alleviates mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease cybrid cell. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1842 (2), 220-231 (2014).
Baloyannis, S. J., Costa, V., Michmizos, D. Mitochondrial alterations Alzheimer’s disease. American Journal of Alzheimer’s Disease & Other Dementias. 19 (2), 89-93 (2004).
Tillement, L., Lecanu, L., Papadopoulos, V. Alzheimer’s disease: Effects of β-amyloid on mitochondria. Mitochondrion. 11 (1), 13-21 (2011).
Choi, S. Y., et al. C9ORF72-ALS/FTD-associated poly(GR) binds Atp5a1 and compromises mitochondrial function in vivo. Nature Neuroscience. 22 (6), 851-862 (2019).
Smith, E. F., Shaw, P. J., De Vos, K. J. The role of mitochondria in amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 710, 132933 (2019).
Costa, V., et al. Mitochondrial fission and cristae disruption increase the response of cell models of Huntington’s disease to apoptotic stimuli. EMBO Molecular Medicine. 2 (12), 490-503 (2010).
Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease: Mitochondrial and Huntington’s disease. The EMBO Journal. 31 (8), 1853-1864 (2012).
Vanisova, M., et al. Mitochondrial organization and structure are compromised in fibroblasts from patients with Huntington’s disease. Ultrastructural Pathology. 46 (5), 462-475 (2022).
de Barcelos, I. P., Troxell, R. M., Graves, J. S. Mitochondrial dysfunction and multiple sclerosis. 生物学. 8 (2), 37 (2019).
Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441, 1157-1161 (2006).
Meng, H., et al. Loss of Parkinson’s disease-associated protein CHCHD2 affects mitochondrial crista structure and destabilizes cytochrome c. Nature Communications. 8, 15500 (2017).
Lu, L., et al. CHCHD2 maintains mitochondrial contact site and cristae organizing system stability and protects against mitochondrial dysfunction in an experimental model of Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 135 (13), 1588-1596 (2022).
Cogliati, S., et al. Mitochondrial Cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
He, B., et al. Mitochondrial cristae architecture protects against mtDNA release and inflammation. Cell Reports. 41 (10), 111774 (2022).
Polo, C. C., et al. Three-dimensional imaging of mitochondrial cristae complexity using cryo-soft X-ray tomography. Scientific Reports. 10, 21045 (2020).
Rybka, V., et al. Transmission electron microscopy study of mitochondria in aging brain synapses. Antioxidants. 8 (6), 171 (2019).
Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 542-548 (2006).
Fry, M. Y., et al. In situ architecture of Opa1-dependent mitochondrial cristae remodeling. biorxiv. , (2023).
Barad, B. A., Medina, M., Fuentes, D., Wiseman, R. L., Grotjahn, D. A. Quantifying organellar ultrastructure in cryo-electron tomography using a surface morphometrics pipeline. The Journal of Cell Biology. 222 (4), 202204093 (2023).
Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 617 (2020).
Yang, Z., et al. Cyclooctatetraene-conjugated cyanine mitochondrial probes minimize phototoxicity in fluorescence and nanoscopic imaging. Chemical Science. 11 (32), 8506-8516 (2020).
Liu, T., et al. Multi-color live-cell STED nanoscopy of mitochondria with a gentle inner membrane stain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (52), e2215799119 (2022).
Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11, 3699 (2020).
Zheng, S., et al. Long-term, super-resolution HIDE imaging of the inner mitochondrial membrane in live cells with a cell-permeant lipid probe. biorxiv. , (2022).
Wang, C., et al. A photostable fluorescent marker for the superresolution live imaging of the dynamic structure of the mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15817-15822 (2019).
Feles, S., et al. Streamlining culture conditions for the neuroblastoma cell line sh-sy5y: a prerequisite for functional studies. Methods and Protocols. 5 (4), 58 (2022).
Shipley, M. M., Mangold, C. A., Szpara, M. L. Differentiation of the SH-SY5Y human neuroblastoma cell line. Journal of Visualized Experiments. (108), e53193 (2016).
Kovalevich, J., Langford, D., Amini, S., White, M. K. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Neuronal Cell Culture. 1078, 9-21 (2013).
Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. 癌症研究. 33 (11), 2643-2652 (1973).
Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 62 (3), 1403-1416 (2018).
Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30 (2020).
Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction in aging and alzheimer’s disease: strategies to protect neurons. Antioxidants & Redox Signaling. 9 (10), 1647-1658 (2007).
Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154 (2020).
Korecka, J. A., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PLoS ONE. 8 (5), e63862 (2013).
Baghel, M. S., Thakur, M. K. Vdac1 downregulation causes mitochondrial disintegration leading to hippocampal neurodegeneration in scopolamine-induced amnesic mice. Molecular Neurobiology. 56 (3), 1707-1718 (2019).
Jiang, S., et al. Mfn2 ablation causes an oxidative stress response and eventual neuronal death in the hippocampus and cortex. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 5 (2018).
Mu, Y., Gage, F. H. Adult hippocampal neurogenesis and its role in Alzheimer’s disease. Molecular Neurodegeneration. 6, 85 (2011).
Rao, Y. L., et al. Hippocampus and its involvement in Alzheimer’s disease: a review. 3 Biotech. 12 (2), 55 (2022).
Weerasinghe-Mudiyanselage, P. D. E., Ang, M. J., Kang, S., Kim, J. -. S., Moon, C. Structural Plasticity of the hippocampus in neurodegenerative diseases. International Journal of Molecular Sciences. 23 (6), 3349 (2022).
. Poly-D-Lysine Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401 (2023)
Dravid, A., Raos, B., Svirskis, D., O’Carroll, S. J. Optimised techniques for high-throughput screening of differentiated SH-SY5Y cells and application for neurite outgrowth assays. Scientific Reports. 11, 23935 (2021).
Hromadkova, L., et al. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) promotes molecular polarization and differentiation of immature neuroblastoma cells into definitive neurons. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1867 (9), 118737 (2020).
Riegerová, P., et al. Expression and Localization of AβPP in SH-SY5Y cells depends on differentiation state. Journal of Alzheimer’s Disease. 82 (2), 485-491 (2021).
Hoffmann, L. F., et al. Neural regeneration research model to be explored: SH-SY5Y human neuroblastoma cells. Neural Regeneration Research. 18 (6), 1265-1266 (2022).
Abiraman, K., Tzingounis, A. V., Lykotrafitis, G. K. Ca 2 channel localization and regulation in the axon initial segment. The FASEB Journal. 32 (4), 1794-1805 (2018).
E18 Rat Hippocampus. Transnetyx Tissue Available from: https://tissue.transnetyx.com/E18-Rat-Hippocampus_4 (2023)
Kmito ORANGE – Probe for live cell imaging of mitochondria. Spirochrome Available from: https://spirochrome.com/product/pkmito_orange/ (2023)
Nyquist Calculator. Scientific Volume Imaging Available from: https://svi.nl/Nyquist-Calculator (2023)
Segawa, M., et al. Quantification of cristae architecture reveals time-dependent characteristics of individual mitochondria. Life Science Alliance. 3 (7), e2019000620 (2020).
Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
Stephan, T., Roesch, A., Riedel, D., Jakobs, S. Live-cell STED nanoscopy of mitochondrial cristae. Scientific Reports. 9, 12419 (2019).
Erdmann, R. S., et al. Labeling strategies matter for super-resolution microscopy: A comparison between HaloTags and SNAP-tags. Cell Chemical Biology. 26 (4), 584-592 (2019).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Ng, E. L., Reed, A. L., O’Connell, C. B., Alder, N. N. Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models. J. Vis. Exp. (196), e65561, doi:10.3791/65561 (2023).