RGBradford: Quantificação de proteínas com uma câmera de smartphone

Independentemente do uso a jusante (por exemplo, ELISA, cinética enzimática, western blotting, purificação de proteínas e espectrometria de massa), a quantificação de proteínas é crucial para análises precisas em laboratórios de ciências da vida. Além de seu uso como leituras secundárias (ou seja, para calcular níveis relativos de analitos por massa de proteína), os níveis de proteína em uma amostra também podem ser a saída desejada em si. Por exemplo, pode-se estar interessado nos níveis de proteína nos recursos alimentares¹ ou na urina². Existem muitos métodos disponíveis para medir a concentração de proteínas em amostras³, incluindo leituras diretas de absorbância UV⁴, quelação proteína-cobre ^5,6, ensaios colorimétricos de ligação proteína-corante⁷ e ensaios fluorescentes de ligação proteína-corante⁸. A relevância da quantificação de proteínas é evidenciada pela presença de dois trabalhos descrevendo métodos de dosagem de^{proteínas5,7} no top-3 da literatura mais^citada9,10. Apesar do fato de que muitos autores negligenciam sua citação real citando referências não primárias ou não citando nada, os artigos originais descrevendo o ensaio de proteína de Lowry e o ensaio de proteína de Bradford totalizam > 200.000 citações a cada¹⁰.

A popularidade do ensaio de Bradford deriva de sua acessibilidade, simplicidade, velocidade e sensibilidade. O ensaio é baseado na interação entre proteínas e o corante Coomassie Brilliant Blue G sob condições ácidas. Sob as condições do ensaio (isto é, pH baixo), o corante existe em três formas: uma forma catiônica vermelha com λmax a 470 nm; uma forma neutra verde com λmax a 650 nm; e uma forma aniônica azul com λmax a 590 nm^11,12 (Figura 1). A forma catiônica predomina na ausência de proteínas. À medida que as proteínas interagem com o corante, elas estabilizam a forma aniônica azul, causando uma mudança perceptível na cor da solução, de acastanhada para azul. Normalmente, a mudança na concentração da forma azul do corante é quantificada espectrofotometricamente, cuja absorbância a 590-595 nm é proporcional à quantidade de proteína no ensaio.

Figura 1: Espectros de absorção de Coomassie azul brilhante G nas condições do ensaio de Bradford. Os três picos principais são marcados com setas indicando o λmax das formas vermelha (470 nm), verde (650 nm) e azul (590 nm) do corante. Os espectros foram registrados na ausência de proteína (linha amarela) e na presença de 3 μg (linha cinza) e 10 μg (linha azul) de albumina de soro bovino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O amplo uso do ensaio de Bradford levou à identificação de várias limitações (por exemplo, respostas variáveis a diferentes proteínas¹¹ e interferência de lipídios¹³ e detergentes⁷) e ao desenvolvimento de modificações para melhorar seu desempenho (por exemplo, adição de detergentes^14,15, alcalinização^14,16 e uso da razão de absorbâncias¹⁷). Além das modificações no próprio ensaio, também tem sido descrito o uso de dispositivos alternativos, como smartphones ou câmeras, para captação de sinais analíticos 18,19,20. De fato, o desenvolvimento de métodos que fazem uso de smartphones como analisadores químicos portáteis tem sido uma área ativa de pesquisa. A motivação para o uso de smartphones decorre da acessibilidade, portabilidade, facilidade de uso e ampla disponibilidade desses dispositivos.

Este trabalho fornece um protocolo para quantificação de proteínas usando o ensaio RGBradford²⁰, que usa um smartphone como dispositivo analítico. Em contraste com a publicação RGBradford original²⁰, aqui, um procedimento que agiliza o processo de extração de cores foi introduzido. Envolve a utilização de um aplicativo de software disponível gratuitamente para extrair informações de cor de cada poço de uma imagem de microplaca automaticamente, economizando tempo e esforço significativos. Esta é uma alternativa ao método anterior de aquisição manual de dados de cores de cada poço, um a um, usando um aplicativo de software editor gráfico²⁰. Em última análise, os níveis de proteína em amostras podem ser quantificados usando dados de cor extraídos de uma foto de uma microplaca tirada com um smartphone.