RGBradford: Eiwitkwantificering met een smartphonecamera

Ongeacht het stroomafwaartse gebruik (bijv. ELISA, enzymkinetiek, western blotting, eiwitzuivering en massaspectrometrie), is eiwitkwantificering cruciaal voor nauwkeurige analyse in biowetenschappelijke laboratoria. Naast het gebruik ervan als secundaire uitlezingen (d.w.z. om de relatieve niveaus van analyten per massa eiwit te berekenen), kunnen eiwitniveaus in een monster ook de gewenste output zelf zijn. Men kan bijvoorbeeld geïnteresseerd zijn in het eiwitgehalte in voedselbronnen¹ of in urine². Er zijn veel methoden beschikbaar om de eiwitconcentratie in monsters³ te meten, waaronder directe UV-absorptiemetingen⁴, eiwit-koperchelatie ^5,6, eiwit-kleurstofbindende colorimetrische assays⁷ en eiwit-kleurstofbindende fluorescerende assays⁸. De relevantie van eiwitkwantificering blijkt uit de aanwezigheid van twee artikelen die eiwitmeetmethoden^{beschrijven 5,7} in de top-3 van de meest geciteerde literatuur ^9,10. Ondanks het feit dat veel auteurs hun eigenlijke citaat verwaarlozen door niet-primaire referenties te citeren of helemaal niets te citeren, bedragen de originele artikelen die de Lowry-eiwittest en de Bradford-eiwittest beschrijven elk > 200.000 citaties^.

De populariteit van de Bradford-test komt voort uit de betaalbaarheid, eenvoud, snelheid en gevoeligheid. De test is gebaseerd op de interactie tussen eiwitten en de kleurstof Coomassie Brilliant Blue G onder zure omstandigheden. Onder de omstandigheden van de test (d.w.z. lage pH) bestaat de kleurstof in drie vormen: een rode kationische vorm met λmax bij 470 nm; een groene neutrale vorm met λmax bij 650 nm; en een blauwe anionische vorm met λmax bij 590 nm^11,12 (Figuur 1). De kationische vorm overheerst bij afwezigheid van eiwitten. Terwijl eiwitten interageren met de kleurstof, stabiliseren ze de blauwe anionische vorm, waardoor een merkbare verandering in de kleur van de oplossing ontstaat, van bruinachtig naar blauw. Gewoonlijk wordt de verandering in de concentratie van de blauwe vorm van de kleurstof spectrofotometrisch gekwantificeerd, waarvan de absorptie bij 590-595 nm evenredig is met de hoeveelheid eiwit in de test.

Figuur 1: Coomassie briljantblauwe G-absorptiespectra onder de omstandigheden van de Bradford-test. De drie hoofdpieken zijn gemarkeerd met pijlen die de λmax aangeven van de rode (470 nm), groene (650 nm) en blauwe (590 nm) vormen van de kleurstof. Spectra werden geregistreerd in afwezigheid van eiwit (gele lijn) en in aanwezigheid van 3 μg (grijze lijn) en 10 μg (blauwe lijn) runderserumalbumine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het wijdverbreide gebruik van de Bradford-test heeft geleid tot de identificatie van verschillende beperkingen (bijv. variabele reacties op verschillende eiwitten¹¹ en interferentie door lipiden¹³ en wasmiddelen⁷) en de ontwikkeling van modificaties om de prestaties ervan te verbeteren (bijv. de toevoeging van wasmiddelen^14,15, alkalinisatie^14,16 en gebruik van de verhouding van absorptie¹⁷). Naast aanpassingen in de test zelf, is ook het gebruik van alternatieve apparaten, zoals smartphones of camera’s, om analytische signalen op te vangen beschreven 18,19,20. De ontwikkeling van methoden die gebruik maken van smartphones als draagbare chemische analysatoren is inderdaad een actief onderzoeksgebied geweest. De motivatie voor het gebruik van smartphones komt voort uit de betaalbaarheid, draagbaarheid, gebruiksgemak en wijdverbreide beschikbaarheid van deze apparaten.

Dit artikel biedt een protocol voor eiwitkwantificering met behulp van de RGBradford-assay²⁰, die een smartphone als analytisch apparaat gebruikt. In tegenstelling tot de originele RGBradford-publicatie²⁰ is hier een procedure geïntroduceerd die het kleurextractieproces stroomlijnt. Het omvat het gebruik van een vrij beschikbare softwaretoepassing om automatisch kleurinformatie uit elk putje van een microplaatafbeelding te extraheren, wat veel tijd en moeite bespaart. Dit is een alternatief voor de vorige methode om handmatig één voor één kleurgegevens uit elk putje te verkrijgen met behulp van een softwaretoepassing voor grafische editor²⁰. Uiteindelijk kunnen eiwitniveaus in monsters worden gekwantificeerd met behulp van kleurgegevens die zijn geëxtraheerd uit een foto van een microplaat die met een smartphone is gemaakt.