Introduzione all'elaborazione, all'adattamento e all'interpretazione dei dati di assorbimento transitorio
Summary
Questo protocollo è un punto di partenza per principianti nell’elaborazione, nell’adattamento e nell’interpretazione degli spettri di assorbimento transitorio. L’obiettivo di questo protocollo è la preparazione di set di dati e l’adattamento utilizzando sia la cinetica a singola lunghezza d’onda che l’analisi del tempo di vita globale. Vengono discusse le sfide associate ai dati di assorbimento transitorio e al loro adattamento.
Abstract
La spettroscopia di assorbimento transitorio (TA) è un potente metodo spettroscopico risolto nel tempo utilizzato per tracciare l’evoluzione dei processi di stato eccitato attraverso cambiamenti nello spettro di assorbimento del sistema. Le prime implementazioni di TA erano limitate a laboratori specializzati, ma l’evoluzione dei sistemi commerciali chiavi in mano ha reso la tecnica sempre più disponibile per i gruppi di ricerca di tutto il mondo. I moderni sistemi TA sono in grado di produrre grandi set di dati ad alta risoluzione energetica e temporale ricchi di informazioni fotofisiche. Tuttavia, l’elaborazione, l’adattamento e l’interpretazione degli spettri TA possono essere difficili a causa del gran numero di caratteristiche dello stato eccitato e degli artefatti strumentali. Molti fattori devono essere attentamente considerati durante la raccolta, l’elaborazione e l’adattamento dei dati TA al fine di ridurre l’incertezza su quale modello o insieme di parametri di adattamento descriva meglio i dati. L’obiettivo della preparazione e dell’adattamento dei dati è quello di ridurre il maggior numero possibile di questi fattori estranei, preservando al contempo i dati per l’analisi. In questo metodo, ai principianti viene fornito un protocollo per l’elaborazione e la preparazione dei dati TA, nonché una breve introduzione alle procedure e ai modelli di fitting selezionati, in particolare l’adattamento a lunghezza d’onda singola e l’analisi della durata globale. Viene fornito un commento su una serie di sfide comuni nella preparazione dei dati e sui metodi per affrontarle, seguito da una discussione delle sfide e dei limiti di questi semplici metodi di adattamento.
Introduction
La spettroscopia di assorbimento transitorio (TA) è una tecnica spettroscopica risolta nel tempo che monitora l’evoluzione delle specie fotoeccitate attraverso cambiamenti dipendenti dal tempo del loro spettro di assorbimento in seguito all’eccitazione con un impulso di luce. Poiché l’AT è una tecnica di assorbimento, i segnali spettroscopici che derivano da stati che subiscono sia transizioni radiative (cioè stati che tipicamente emettono un fotone) che transizioni non radiative (stati che sono tipicamente non fluorescenti e subiscono conversione interna, incrocio intersistemico o partecipano a fotoreazioni) possono essere identificati e la loro evoluzioneseguita 1,2. A seconda delle specifiche della sorgente di eccitazione e del metodo di rilevamento, TA consente l’accesso alla cinetica dai femtosecondi ai microsecondi e dall’UV all’infrarosso lontano, rendendolo uno strumento spettroscopico versatile. La commercializzazione degli spettrometri TA è progredita in modo significativo negli ultimi decenni, portando un maggior numero di laboratori e strutture ad avere accesso a questa potente tecnica2.
I moderni sistemi TA sono in grado di produrre grandi set di dati con un’elevata risoluzione energetica e temporale. I set di dati assumono generalmente la forma di una matrice 2D di valori di differenza di trasmittanza o assorbanza in funzione della lunghezza d’onda e del ritardo temporale rispetto all’impulso di eccitazione. Questo set di dati può essere visualizzato come una mappa termica bidimensionale o una mappa topografica tridimensionale. L’interpretazione di questi dati è diventata più complessa man mano che i ricercatori si sforzano di includere l’intero set di dati quando generano adattamenti che descrivono al meglio il loro sistema di interesse3.
Sebbene l’AT possa coprire un’ampia gamma di lunghezze d’onda e scale temporali, questo protocollo si concentra su una delle sue forme più ampiamente accessibili4: la spettroscopia a banda larga nella regione UV-visibile guidata da un laser pulsato a femtosecondi. Uno schema 5,6 di tale strumento è riportato nella Figura 1. L’esperimento inizia prendendo un impulso dal laser e dividendolo in due copie. Una copia dell’impulso, chiamata “pompa”, viene utilizzata per eccitare il campione. Un dispositivo come un amplificatore parametrico ottico (OPA) viene tipicamente utilizzato per trasformare l’impulso della pompa alla lunghezza d’onda di eccitazione desiderata 5,7. La seconda copia dell’impulso, chiamata “sonda”, entra in una fase di ritardo meccanico, che può variare il ritardo temporale tra gli impulsi della pompa e della sonda variando la distanza percorsa dall’impulso. L’impulso della sonda a lunghezza d’onda singola viene quindi trasformato in un continuum di luce bianca utilizzando un cristallo di zaffiro o fluoruro di calcio (CaF2)8. L’impulso di luce bianca viene fatto passare attraverso il campione e il suo spettro viene misurato utilizzando un rivelatore a banda larga come una fotocamera CCD (Charge-Coupled Device). Misurando le variazioni nello spettro dell’impulso di luce bianca con e senza la pompa, è possibile misurare le variazioni nello spettro di assorbimento del campione indotte dalla pompa, ΔA(T). I lettori interessati sono indirizzati a questa utile recensione9 per ulteriori informazioni sul processo di rilevamento.
In tutte le forme di spettroscopia TA, gli spettri ΔA(t) sono calcolati prendendo la differenza tra l’assorbimento dello stato fondamentale,sonda A, e quello dello stato eccitato,A pompa+sonda, ad un dato ritardo temporale, t, tra i due impulsi 2,5,9,10.
(1)
Si noti che unasonda è equivalente allo spettro di assorbimento allo stato stazionario del campione ed è indipendente dal tempo; la risoluzione temporale dell’esperimento deriva dal ritardo tra la pompa e la sonda catturata in Apompa+sonda(t). Una simulazione di questi dati è mostrata nella Figura 2A.
A differenza degli spettri di assorbimento in regime stazionario, gli spettri TA possono avere caratteristiche sia positive che negative a causa della differenza presa nell’equazione 1. Le caratteristiche positive sono il risultato di nuove specie assorbenti create dall’impulso di pompa e possono rappresentare stati cromofori eccitati, stati di tripletto, riarrangiamenti geometrici, effetti di solvatazione o fotoprodotti in stato eccitato3. Nella discussione verranno presentate le linee guida generali per l’identificazione di queste caratteristiche e l’assegnazione alle specie chimiche. Le caratteristiche negative possono derivare dalla candeggina allo stato fondamentale (GSB) o dall’emissione stimolata (SE) (Figura 2B). Il GSB è dovuto alla perdita di popolazione dello stato fondamentale in seguito all’assorbimento dell’impulso di pompa. Le molecole promosse allo stato eccitato non assorbono più nella stessa regione del loro stato fondamentale; pertanto, viene assorbito meno impulso della sonda e la differenza nell’equazione 1 può essere negativa in quella regione. Il GSB è caratterizzato dall’avere la stessa forma spettrale di quello dell’assorbimento allo stato fondamentale ma con un segno opposto. I segnali SE derivano dall’emissione da una specie in stato eccitato stimolata dall’impulso della sonda3. L’emissione di queste specie fa sì che più luce raggiunga il rivelatore, il che equivale ad avere un minore assorbimento a quelle lunghezze d’onda. Il segnale SE avrà una forma spettrale simile a quella dello spettro di emissione spontanea della specie, ma con un segno negativo e un diverso peso di frequenza10.
Oltre alle informazioni sulle specie in stato eccitato, gli spettri TA possono contenere una serie di artefatti e caratteristiche estranee che possono distorcere la dinamica sottostante e oscurare l’assegnazione delle bande di assorbimento11. Il trattamento improprio di questi artefatti nella preparazione e nell’analisi dei dati può portare all’applicazione di modelli fotofisici inappropriati ai dati e, di conseguenza, a conclusioni fuorvianti11. Pertanto, la prima parte di questo protocollo si concentra su come elaborare correttamente i set di dati TA dopo che sono stati raccolti. L’obiettivo di questa sezione è quello di fornire ai ricercatori che si avvicinano per la prima volta all’AT una serie di linee guida che aiuteranno a sviluppare un’intuizione e un apprezzamento per la preparazione e l’elaborazione rigorosa dei loro dati.
Dopo l’elaborazione di un set di dati, sono disponibili una pletora di strumenti e modelli per l’adattamento e l’interpretazione degli spettri con vari livelli di complessità e rigore10. L’obiettivo della seconda sezione di questo protocollo è quello di preparare il lettore ad applicare l’adattamento a singola lunghezza d’onda e l’analisi globale ai dati e di fornire indicazioni su quando questi modelli sono appropriati per descrivere i loro dati. Il software commerciale è ora prontamente disponibile per la preparazione e il trattamento dei dati TA, come Surface Xplorer 12,13 dei sistemi Ultrafast (scaricabile e utilizzabile gratuitamente, vedere la tabella dei materiali). Altre alternative gratuite sono state rilasciate da ricercatori accademici, come Glotaran14. Glotaran è un programma software gratuito sviluppato per l’analisi globale e target di dati di spettroscopia e microscopia risolti nel tempo. Funge da interfaccia utente grafica (GUI) per il pacchetto R TIMP14. Inoltre, gli utenti possono utilizzare linguaggi di programmazione come Python per scrivere i propri codici che eseguono l’analisi. Ognuno di questi software e soluzioni di programmazione ha caratteristiche positive che li rendono contributi importanti. Ai fini di questo studio, possiamo presentare un solo software per la componente visiva di questa attività. Una discussione approfondita di ciascun software di fitting esula dallo scopo di questo articolo.
Questo articolo fornisce una procedura dettagliata per (1) l’elaborazione dei dati TA, (2) l’adattamento dei dati TA utilizzando la cinetica a singola lunghezza d’onda e l’analisi globale e (3) l’estrazione dei dati e l’adattamento ad altri modelli. È incluso un insieme di dati TA rappresentativi che il lettore può utilizzare come pratica (File supplementare 1 e File supplementare 2). I dati sono una misurazione di un campione di 165 μM di 1,4-bis(5-fenilossazolo-2-il)benzene (POPOP) in etanolo eccitato a 330 nm e raccolto in un intervallo da -5 ps a 5,5 ns. Inoltre, un campione “bianco” contenente solo etanolo e nessun campione è stato raccolto nelle stesse condizioni sperimentali in un intervallo compreso tra −5 ps e 5 ps, che viene utilizzato nella preparazione dei dati per il fitting (fase 1). Gli spettri sono stati raccolti utilizzando uno spettrometro ultraveloce ad assorbimento transitorio. Il campione è stato contenuto in una cuvetta di 2 mm di lunghezza del percorso e sottoposto a costante agitazione. La procedura di elaborazione e adattamento descritta si basa sul software Surface Xplorer che adatta i dati nel formato *.ufs e che di seguito verrà chiamato “programma di adattamento”. Sono disponibili programmi per la conversione di set di dati in altri formati in file *.ufs15. Sebbene i dettagli di questo protocollo siano specifici per Surface Xplorer, i passaggi che seguono sono generalizzabili a qualsiasi pacchetto software, commerciale o costruito in casa. Inoltre, i risultati dell’elaborazione dei dati possono essere estratti e adattati utilizzando questi altri pacchetti software. Un fascicolo informativo di supporto (fascicolo supplementare 3) fornisce ulteriori consigli sul montaggio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Considerazioni generali per la preparazione dei dati
L’adattamento dei dati TA può sembrare a prima vista relativamente semplice e ci si potrebbe aspettare che una “risposta” chiara e corretta dovrebbe risultare per un dato set di dati. Tuttavia, come evidenziato nel protocollo, ci sono molti fattori nell’acquisizione, nella preparazione dei dati e nell’analisi dei dati da considerare attentamente che possono portare a incertezza su quale modello o insieme di parametri di adattamento descrive meglio i dati. L’obiettivo della preparazione e dell’adattamento dei dati è quello di ridurre il maggior numero possibile di questi fattori estranei, preservando al contempo i dati per l’analisi. Il compito a portata di mano potrebbe sembrare scoraggiante per un principiante, poiché c’è molto da considerare. Per acquisire un’idea del processo di adattamento, il principiante è incoraggiato a provare a preparare gli stessi dati più volte da zero in modi leggermente diversi per verificare in che modo le fasi di preparazione dei dati influiscono notevolmente sull’adattamento migliore. Inoltre, due ricercatori diversi possono preparare e adattare gli stessi dati e confrontare i risultati. Questo processo può richiedere molto tempo le prime volte, tuttavia, ciò consentirà al principiante di sviluppare intuizioni su come preparare in modo coerente i dati per i campioni futuri. Come ogni abilità, la preparazione e l’adattamento dei dati richiederanno tempo per svilupparsi e il principiante è incoraggiato a essere paziente e disciplinato durante la sperimentazione e l’apprendimento del processo. Il set di dati utilizzato in questo studio viene fornito per dare al principiante la possibilità di adattarsi direttamente al tutorial e di confrontare direttamente i risultati con quelli prodotti nel tutorial.
I dati possono contenere caratteristiche di fondo che sono presenti in tutti i ritardi temporali (Figura 2 supplementare e Figura 3 supplementare) come la dispersione del fascio della pompa e l’emissione spontanea del campione. Queste caratteristiche indesiderate devono essere rimosse al fine di isolare il segnale di assorbimento transitorio dalla specie di interesse11. La rimozione di tali caratteristiche viene effettuata scegliendo, calcolando la media e rimuovendo il contributo di un certo numero di spettri di differenza temporale negativa. Quando si selezionano gli spettri di sfondo, è importante assicurarsi che non vengano incluse per la rimozione le caratteristiche che potrebbero far parte del processo di interesse. Nei dati di TA si possono osservare anche le caratteristiche di fondo derivanti dal solvente, come l’assorbimento da parte delle impurità o del solvente stesso. Quando il solvente produce un segnale, un set di dati “vuoto” contenente solo il solvente eseguito nelle stesse identiche condizioni sperimentali del campione dovrà essere sottratto dal set di dati del campione. I dettagli su questa procedura sono inclusi nel file supplementare 3.
La correzione del cinguettio è un altro fattore da considerare attentamente. Il chirp si verifica quando l’impulso della sonda viaggia verso il campione e si allarga a causa di imperfezioni negli specchietti dello sterzo o passando attraverso ottiche dispersive come lenti o filtri. Il risultato finale è che i fotoni a bassa energia nell’impulso della sonda (cioè il lato rosso dello spettro della sonda) arrivano al campione prima dei fotoni a energia più alta (cioè il lato blu dello spettro della sonda). Ciò si traduce nel “tempo zero” degli spettri TA che viene spalmato su diversi femtosecondi o picosecondi18, che si manifesta come una curva distinta nel set di dati grezzo che inizia nelle lunghezze d’onda blu e poi si appiattisce man mano che si avvicina al rosso (Figura 7 supplementare). Chirp è più evidente su scale temporali più brevi come quelle a cui si accede da TA ultraveloce. Questo tempo zero dipendente dalla lunghezza d’onda può essere corretto come descritto nel protocollo, ma l’applicazione di questo processo può essere complicata e soggettiva. Avere un campione “bianco” o una misurazione della risposta di Kerr del solvente può ridurre al minimo la natura soggettiva dei punti di prelievo manuale per la correzione del chirp necessaria per generare l’adattamento polinomiale utilizzato per regolare e correggere il chirp. L’obiettivo della correzione del cinguettio è quello di rimuovere la “curva” distinta del tempo zero. Potrebbero essere necessari più tentativi di adattamento del chirp per ottenere i migliori dati corretti dal chirp. I dati possono essere adattati più volte con diverse correzioni chirp applicate al fine di ottenere una comprensione dell’impatto che la correzione chirp ha sui valori delle brevi durate TA.
Artefatti che appaiono al “tempo zero”
Diversi artefatti possono essere osservati vicino al “tempo zero” nei dati TA, tra cui lo scattering di Rayleigh, lo scattering Raman stimolato e la modulazione di fase incrociata. Lo scattering di Rayleigh del fascio della pompa è uno scattering elastico che si verifica senza una variazione di energia. Questa funzione apparirà alla stessa lunghezza d’onda dell’impulso della pompa. Lo scattering Raman stimolato può accompagnare il segnale di scattering della pompa19. Lo scattering Raman, che deriva dalla dispersione anelastica di un fotone di pompa, produce picchi sia a energia più alta (anti-Stokes) che a energia più bassa (Stokes) rispetto all’energia della pompa incidente. Nei dati TA, si osserva lo scattering Raman stimolato a causa dell’irradiazione simultanea del campione con i fasci della pompa e della sonda. Quando il fascio della sonda interagisce con il campione contemporaneamente al fascio della pompa, stimola il processo Raman. Pertanto, lo scattering Raman stimolato si verifica intorno al tempo zero e si traduce in ulteriori picchi negli spettri entro le prime centinaia di femtosecondi (Figura 6, osservata nello spettro blu più scuro nella regione evidenziata e Figura 17 supplementare). La modulazione cross-phase ha origine dalla modulazione dell’indice di rifrazione del solvente dall’interazione con l’intenso campo elettrico di un impulso.
Lo scattering Raman stimolato può essere distinto dalla modulazione a fase incrociata perché i picchi Raman appaiono a frequenze specifiche che corrispondono ai modi vibrazionali del solvente. Poiché si tratta di un processo Raman, è possibile osservare sia le linee di Stokes che quelle anti-Stokes su entrambi i lati dell’eccitazione. I solventi clorurati come il cloruro di metilene mostrano bande Raman molto prominenti a causa della grande polarizzabilità del cloro. Le firme spettrali della modulazione di fase incrociata sono uniche per un solvente, ma non sono così facilmente prevedibili come le caratteristiche di scattering Raman.
A seconda della cinetica del campione misurato, lo scattering di Rayleigh, lo scattering Raman e la modulazione di fase incrociata possono sovrapporsi alle caratteristiche iniziali dei dati TA e possono essere difficili da rimuovere dai dati. In linea di principio, queste caratteristiche possono essere viste in una misurazione ordinata del solvente e sottratte dai dati, i programmi di analisi dei dati possono avere funzioni di adattamento per tenere conto di queste caratteristiche, ma in pratica questo può essere difficile. Quando è troppo difficile sottrarre questi artefatti senza compromettere i dati del campione, potrebbe essere meglio ritagliare gli spettri compromessi intorno al tempo zero per eliminare gli artefatti. In questo modo si avrà lo sfortunato effetto collaterale di rimuovere i primi circa 300 fs di dati, ma si renderà l’adattamento più affidabile in seguito. Nel corso dell’analisi di più set di dati dello stesso campione e di campioni diversi, il principiante acquisirà intuizione nel raggiungere questo equilibrio tra la sottrazione della superficie di sfondo e il ritaglio dei dati iniziali di 100-200 fs.
Il ritaglio generale può essere necessario per porzioni di spettri che contengono un basso rapporto segnale/rumore. L’instabilità del fascio della sonda in determinate regioni, la bassa intensità della luce della sonda, le concentrazioni del campione troppo elevate (bloccando così gran parte della sonda incidente), la bassa intensità della pompa e la sezione trasversale di assorbimento del campione sono i tipici colpevoli del basso rapporto segnale/rumore che possono rendere difficile l’adattamento dei dati. In questi casi, ritagliare il set di dati su entrambi i lati della finestra ottica per ottenere il livello desiderato di segnale-rumore può aiutare il processo di adattamento.
Un set di dati è pronto per l’analisi una volta che è stato sufficientemente ritagliato per rimuovere le sezioni povere del set di dati, il chirp corretto e gli spettri di sfondo sono stati mediati e sottratti. Questa procedura dovrebbe risultare in dati che contengano solo le parti più rilevanti per la fotofisica e la fotochimica di interesse. In effetti, è chiaro che c’è un certo grado di soggettività in questo processo. L’obiettivo nella preparazione dei dati è quello di trovare un equilibrio tra la rimozione degli artefatti in modo che non perturbino l’adattamento, ma non la rimozione così tanto da compromettere l’integrità del set di dati, ostacolandone così l’interpretazione. Trovare questo equilibrio richiede tempo ed esperienza per costruire l’intuizione di ciò che è un artefatto e ciò che è un dato. Adattare (e riadattare) lo stesso set di dati in più giorni diversi, o avere due ricercatori che adattano gli stessi dati, può essere un modo per ridurre al minimo l’errore umano e la soggettività della preparazione e dell’analisi dei dati.
Considerazioni generali per l’adattamento e l’interpretazione
Dopo che gli spettri TA grezzi sono stati elaborati, questi devono essere interpretati e modellati per estrarre informazioni sulle specie e sulle dinamiche presenti nel sistema di interesse. Questo processo può essere descritto come una procedura in tre fasi che include l’interpretazione spettrale iniziale, la modellazione/adattamento quantitativo e l’assegnazione dell’interpretazione spettrale al modello/adattamento.
Interpretazione spettrale iniziale: Nella fase di interpretazione spettrale, l’obiettivo è quello di assegnare le caratteristiche presenti negli spettri TA agli stati elettronici a cui si accede nell’evoluzione fotofisica o fotochimica del sistema. Per cominciare, è necessario identificare i vari stati. In questo lavoro, gli stati si riferiscono a stati elettronici unici che fanno parte dell’evoluzione fotofisica o fotochimica del sistema. Uno stato, rappresentato, ad esempio, da una specifica curva di energia potenziale (PEC), possiede un insieme di picchi caratteristici che rappresentano il suo spettro di assorbimento. Una modifica che si verifica all’interno di un singolo stato è chiamata processo. Un processo fotofisico può apparire negli spettri TA come uno spostamento di picco o un cambiamento nell’ampiezza dello spettro. L’aspetto chiave di un processo è che la popolazione dello stato rimane la stessa (cioè, il processo avviene all’interno di un dato PEC); È la distribuzione dell’energia all’interno dello stato che cambia. Un cambiamento nella popolazione di uno stato sarà indicato come transizione. Durante una transizione, il sistema evolve in un’altra PEC (cioè in stato elettronico). Le transizioni possono includere la conversione interna (IC), l’attraversamento intersistemico (ISC), il trasferimento di carica, il trasferimento di energia, la formazione di nuovi prodotti o il ritorno allo stato fondamentale. Le linee guida per l’assegnazione di stati, processi e transizioni sono illustrate nei paragrafi seguenti.
Assegnazione di stati
Il primo passo di questo processo prevede l’assegnazione di caratteristiche spettrali a specifiche specie o stati chimici. Lo stato S1 in TA dovrebbe mostrare un tempo di vita che corrisponda al tempo di vita della fluorescenza ottenuto utilizzando la spettroscopia di emissione risolta nel tempo. Uno stato di tripletta può essere verificato se la sua durata è spenta dall’ossigeno. Se si sospetta un anione o un catione radicale nell’evoluzione fotofisica, la spettroelettrochimica o l’ossidazione/riduzione chimica possono essere eseguite per generare la specie radicalica e uno spettro di assorbimento di tale specie può essere ottenuto e confrontato con la forma della banda TA. La spettroscopia di risonanza di spin elettronico (ESR) può essere eseguita per verificare la presenza di radicali liberi. Un eccellente discorso tutorial ospitato dalla Divisione di Chimica Inorganica dell’ACS fornisce una panoramica dell’AT e di tali considerazioni nell’assegnazione delle funzionalità20. Dopo che le bande sono state assegnate alle specie, il passo successivo nell’interpretazione degli spettri TA è quello di descrivere qualitativamente i processi dinamici che avvengono nel sistema. Questo passaggio è fondamentale in quanto dà al ricercatore un’idea di quali modelli saranno appropriati per descrivere il proprio sistema e fornirà loro una linea di base con cui confrontare i parametri di adattamento.
Modifiche all’interno di uno stato
Il raffreddamento vibrazionale, il riarrangiamento geometrico o la solvatazione sono processi estremamente rapidi (da sub-ps a 10 ps) che possono essere osservati con TA. Il raffreddamento vibrazionale è osservato come un rapido spostamento verso il blu dello spettro TA su una scala temporaledi diversi picosecondi 21,22,23. Il riarrangiamento geometrico può avvenire sulla scala temporale di 10 ps. Le dinamiche di solvatazione sono osservate come uno spostamento verso il rosso e un restringimento dello spettro su diversi picosecondi nei liquidi dipolari convenzionali, ma solventi ad alta viscosità come glicerolo, polietilenglicole (PEG), liquidi ionici e solventi eutettici profondi possono mostrare dinamiche di solvatazione che si verificano nel corso di più nanosecondi 24,25,26.
Cambiamenti nella popolazione di uno stato
Le reazioni sono caratterizzate da un cambiamento nell’intensità di una banda, dove una diminuzione dell’intensità è associata a una diminuzione della concentrazione della sua specie chimica e viceversa per un aumento. In alcuni casi, sia il reagente che la specie del prodotto sono visibili negli spettri, mentre in altri, gli stati del prodotto sono troppo di breve durata o troppo spostati verso il rosso per essere osservati. Spesso le transizioni da stato a stato possono essere osservate dalla presenza di un punto isosbestico negli spettri.
Modellazione quantitativa/adattamento: un modello deve quindi essere adattato ai dati per estrarre informazioni quantitative sulla dinamica del sistema. Come descritto in precedenza nell’introduzione, esiste una vasta gamma di modelli da utilizzare. Questo protocollo si concentra su due dei metodi più comuni: l’adattamento a una singola lunghezza d’onda e l’analisi globale. Il metodo a lunghezza d’onda singola consiste nell’adattare le singole tracce di lunghezza d’onda dagli spettri a una forma funzionale, tipicamente una somma di esponenziali:
(2)
dove ΔA(t) è il segnale TA ad una lunghezza d’onda scelta, n è il numero di componenti esponenziali e aiè l’ampiezza della componente esponenziale, i, con costante di tempo τi. È possibile aggiungere diversi componenti fino a quando l’adattamento non riproduce i dati sperimentali. L’obiettivo di qualsiasi processo di fitting è quello di modellare i dati utilizzando durate sufficienti per riprodurre bene i dati, ma senza sovradimensionare i dati includendo troppi componenti. Di conseguenza, i parametri ponderati di bontà dell’adattamento, ad esempio 
, vengono utilizzati per determinare quando i dati sono adatti alle incertezze sperimentali5.
Dopo che il decadimento è stato adattato in modo soddisfacente, i parametri del modello possono essere utilizzati per caratterizzare la dinamica del sistema. Le costanti di tempo risultanti possono quindi essere estratte e interpretate. Sfortunatamente, il gran numero di caratteristiche sovrapposte negli spettri TA significa che una singola lunghezza d’onda nello spettro può contenere dinamiche corrispondenti a specie diverse le cui firme spettrali si sovrappongono, il che significa che le costanti di tempo estratte da un singolo adattamento di lunghezza d’onda possono rappresentare un composito di più processi coincidenti. Inoltre, qualsiasi cambiamento nella forma della banda e nella posizione influenzerà anche le ampiezze e le costanti di tempo estratte dall’adattamento a lunghezza d’onda singola. Questi problemi possono essere aggirati in alcuni casi con un metodo di adattamento chiamato “analisi della forma delle bande”, in cui si determina o si assume una forma funzionale per le bande TA di ciascuna specie assorbente nel sistema. Queste forme vengono poi pesate in base ad ampiezze dipendenti dal tempo e sommate insieme per riprodurre lo spettro osservato. Questa procedura è comunemente usata nell’analisi degli spettri di fluorescenza risolti nel tempo, ma le forme più complicate e le componenti sovrapposte delle bande TA rendono questo metodo sostenibile solo in pochi semplici casi, come dettagliato altrove10.
Un altro svantaggio dell’adattamento a singola lunghezza d’onda è che non sfrutta intrinsecamente l’ampia gamma spettrale offerta dai moderni esperimenti TA. Si potrebbe, in linea di principio, adattare metodicamente ogni singola lunghezza d’onda degli spettri, ma tale analisi è ingombrante, dispendiosa in termini di tempo e computazionalmente costosa. Per combattere questa sfida, è possibile utilizzare un metodo chiamato “analisi globale” per adattare simultaneamente un intero set di spettri TA a un insieme di parametri dinamici condivisi4. L’analisi globale e un metodo strettamente correlato chiamato analisi del bersaglio sono metodi di successo e ampiamente utilizzati, ma presentano anche una serie unica di inconvenienti e limitazioni. Come per qualsiasi modello, è imperativo comprendere i presupposti utilizzati per crearlo e le limitazioni che presentano.
Nell’analisi globale, gli spettri TA sono rappresentati da una matrice m per n, dove m rappresenta il numero di lunghezze d’onda misurate in ogni spettro e n rappresenta il numero di punti temporali raccolti. Si assume quindi che questa matrice sia scomponibile nel prodotto di altre due matrici:
(3)
dove C(t) è una matrice n per k e S(λ) è una matrice m per k. Il valore k rappresenta il numero di componenti spettrali distinte utilizzate per riprodurre gli spettri. Ognuno di questi componenti rappresenta una specie assorbente con una firma spettrale e una dinamica uniche. La matrice S(λ) rappresenta gli spettri TA delle componenti k e C(t) le loro concentrazioni dipendenti dal tempo. Nell’implementazione più semplice e comune dell’analisi globale, si assume che ogni componente abbia una cinetica esponenziale singola (i = 1 nell’equazione 2, con ogni componente assegnato alla propria costante di tempo). In sintesi, l’intero spettro TA può essere rappresentato dalla somma delle componenti degli spettri k, ognuna con il proprio spettro di assorbimento caratteristico e il singolo decadimento esponenziale.
Quando gli spettri TA sono adattati, l’utente indovina quante componenti (cioè un valore per k) sono necessarie e fa un’ipotesi sulla costante di tempo associata a un decadimento singolo esponenziale di quelle specie. L’installatore genera quindi Cguess(t) e risolve l’equazione 3 per Sfit(t). Successivamente, Sfit(λ) e Cguess(t) vengono moltiplicati come nell’equazione 3 per creare gli spettri adattati, ΔA(λ,t)fit. Infine, i residui, ΔA(λ,t)exp − A(λ,t)fit, sono minimizzati e vengono restituitil’adattamento S(λ) ottimale e le costanti di tempo. La relativa semplicità dell’analisi globale, che rappresenta un intero insieme di spettri utilizzando una manciata di costanti di tempo e componenti spettrali fisse, la rende un metodo attraente (e di successo) per districare le complicate forme di banda e le dinamiche incontrate nella spettroscopia TA. Tuttavia, è necessario prestare attenzione per garantire che l’analisi globale sia un modello appropriato per il sistema in questione.
Un’ipotesi chiave nell’analisi globale, illustrata nell’equazione 3, è la completa separabilità delle porzioni di lunghezza d’onda e tempo della dinamica, una proprietà chiamata “bilinearità”. Questa ipotesi richiede che le forme delle bande componenti siano indipendenti dal tempo (cioè, hanno una forma spettrale fissa che non varia o si sposta nel tempo). L’unica cosa che cambia durante l’esperimento sono le popolazioni relative di ciascun componente, rappresentate da C(t). Su scale temporali lunghe, ~1 ns o giù di lì, questa ipotesi è in genere valida e l’analisi globale può essere utilizzata senza troppe preoccupazioni. D’altra parte, i processi di stato eccitato come il raffreddamento vibrazionale e la dinamica di solvatazione, prominenti sulle scale temporali ultraveloci accessibili da TA a femtosecondi, provocano cambiamenti dipendenti dal tempo nella firma spettrale di una specie e una rottura della bilinearità. Ciò non significa che l’analisi globale non possa riprodurre un set di dati, anzi, può sempre produrre un adattamento soddisfacente a condizione che venga utilizzato un numero sufficiente di componenti. Il problema sta quindi nell’interpretare gli spettri dei componenti e nell’assegnare le costanti di tempo a particolari processi di stato eccitato, poiché i componenti potrebbero non corrispondere più a specie assorbenti distinte. Pertanto, è necessario prestare sempre attenzione quando si applica l’analisi globale a situazioni in cui non è possibile assumere la bilinearità.
Assegnazione dell’interpretazione spettrale al modello/adattamento: una volta ottenuto un adattamento, l’interpretazione spettrale deve essere mappata sulle durate ottenute nell’adattamento. Le durate dell’adattamento sono assegnate sia ai processi che alle reazioni che sono state identificate nell’interpretazione iniziale degli spettri. Tuttavia, la valutazione iniziale degli spettri e il numero di durate adattate ottenute dal modello potrebbero non essere immediatamente mappate l’una sull’altra. In questa (comune!) situazione, l’installatore deve tornare indietro e valutare l’interpretazione iniziale. Forse c’è stato un raffreddamento vibrazionale o un altro processo che è stato perso nella valutazione iniziale, ma è stato identificato nel processo di modellazione e adattamento. Oppure, forse due diversi set di parametri di adattamento potrebbero riprodurre bene i dati e l’interpretazione iniziale può guidare quale set di parametri di adattamento viene scelto. In questa fase finale, l’installatore deve andare avanti e indietro tra l’interpretazione e l’adattamento per trovare una descrizione che porti a un’assegnazione fotofisica plausibile delle specie e delle dinamiche del sistema. È inoltre possibile esplorare altri programmi di fitting che includono modelli di fitting sequenziali, come l’analisi target, per integrare gli accoppiamenti prodotti dall’analisi globale e dal software di fitting presentato in questo articolo4.
In sintesi, questo protocollo discute la preparazione e l’adattamento dei dati di assorbimento transitorio. Il suo obiettivo è quello di evidenziare le sfide associate al processo e di commentare i modi per evitarle o attenuarle in modo pratico. L’adattamento dei dati TA, come l’adattamento della maggior parte dei dati incontrati nei campi tecnici, può essere complicato e, a volte, soggettivo. Pertanto, è fondamentale essere consapevoli del processo e dei limiti dei dati, della preparazione dei dati e degli strumenti matematici utilizzati per modellare e assegnare significato ai dati. Gli scienziati devono affrontare i dati e la modellazione con occhio critico.
Si può tentare di mitigare la soggettività dei loro attacchi. Ad esempio, i dati possono essere preparati e adattati da diversi punti di partenza e in giorni diversi per garantire che venga prodotto lo stesso adattamento. È possibile confrontare i dati rilevati in giorni diversi con una diversa preparazione del campione. Più ricercatori possono inserire gli stessi dati e confrontare i loro risultati. Nel corso del tempo, i ricercatori possono costruire un’intuizione sui dati che ottengono (in base alle specifiche della loro configurazione sperimentale e ai parametri sperimentali) che consentirà loro di essere più sicuri dei loro adattamenti.
C’è molto da imparare sull’adattamento dei dati TA e sui dettagli dei modelli discussi in questo articolo. Si consigliano con entusiasmo diversi eccellenti articoli di recensione che approfondiscono questo argomento 4,10,27. Questo protocollo è pensato per essere un ingresso per principianti nel processo di analisi e adattamento che stimola l’interesse per una comprensione più profonda del processo.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato reso possibile grazie al programma NSF Major Research Instrumentation che ha istituito la struttura laser multiutente per l’assorbimento transitorio (CHE-1428633). Questo materiale si basa sul lavoro sostenuto dalla National Science Foundation nell’ambito della sovvenzione n. CHE-2313290.
Materials
| EtOH 200% Proof | Decon Laboratories Inc | CAS 64-17-5 | Solvent used to prepare Sample |
| Helios transient absorption spectrometer | Ultrafast systems | https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/helios/ | Transient absorption spectrometer |
| POPOP 1,4-Bis[2-(5-phenyloxazolyl)]benzene | Tokyo Chemical Industry | CAS 1806-34-4 | Sample used for Examples |
| Surface Xplorer | Ultrafast systems | https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/surface-xplorer/ | Fitting program |
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