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生物学

Tamiser la pulpe des fruits pour détecter les mouches téphrites immatures dans le champ

Published: July 28, 2023
doi:
10.3791/65501
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1Animal Plant Health Inspection Service (APHIS), Plant Protection and Quarantine (PPQ), Science and Technology (S&T) Miami,United States Department of Agriculture (USDA), 2Division of Plant Industry,Florida Department of Agriculture and Consumer Services, 3APHIS, PPQ, S&T,USDA, 4IFAS, Tropical Research and Education Center,University of Florida, 5Agricultural Research Service (ARS), Pacific Basin Agricultural Research Center,USDA, 6APHIS, PPQ, Field Operations,USDA, 7ARS, Subtropical Horticulture Research Station,USDA

Summary

L’augmentation de la détection des mouches des fruits téphrites immatures sur le terrain peut déclencher des efforts opportuns pour éliminer les populations de ces ravageurs destructeurs. La détection des larves à un stade avancé est plus rapide et plus précise lors du mushing des fruits hôtes dans un sac et du passage de la pulpe à travers une série de tamis que la coupe à la main et l’inspection visuelle.

Abstract

Les mouches des fruits de la famille des Tephritidae sont parmi les ravageurs agricoles les plus destructeurs et envahissants au monde. De nombreux pays entreprennent des programmes d’éradication coûteux pour éliminer les populations naissantes. Au cours des programmes d’éradication, un effort concerté est fait pour détecter les larves, car cela indique fortement une population reproductrice et aide à établir l’étendue spatiale de l’infestation. La détection des stades de vie immatures déclenche des mesures de contrôle et de réglementation supplémentaires pour contenir et prévenir toute nouvelle propagation de l’organisme nuisible. Traditionnellement, la détection larvaire est accomplie en coupant les fruits hôtes individuels et en les examinant visuellement. Cette méthode exige beaucoup de main-d’œuvre, car seul un nombre limité de fruits peut être transformé et la probabilité de manquer une larve est élevée. Une technique d’extraction qui combine i) le mushing du fruit hôte dans un sac en plastique, ii) la filtration de la pulpe à travers une série de tamis, iii) la mise en place de la pulpe retenue dans une solution d’eau de cassonade, et iv) la collecte des larves qui flottent à la surface a été testée. La méthode a été évaluée en Floride avec de la goyave récoltée sur le terrain naturellement infestée par Anastrepha suspensa. Pour imiter les faibles populations plus représentatives d’un programme d’éradication de la mouche des fruits, les mangues et les papayes d’Hawaï ont été infestées par un faible nombre connu de larves de Bactrocera dorsalis . L’applicabilité de la méthode a été testée sur le terrain sur de la goyave naturellement infestée par B. dorsalis afin d’évaluer la méthode dans les conditions rencontrées par les travailleurs lors d’un programme d’urgence contre la mouche des fruits. Dans les essais sur le terrain et en laboratoire, le mushing et le tamisage de la pulpe étaient plus efficaces (nécessitait moins de temps) et plus sensibles (plus de larves trouvées) que la coupe des fruits. Faire flotter la pulpe dans une solution d’eau de cassonade a permis de détecter les larves des stades précoces. Le mushing et le tamisage de la pulpe des fruits d’hôtes téphritidés importants peuvent augmenter la probabilité de détection des larves pendant les programmes d’urgence.

Introduction

Les mouches téphrites des fruits sont parmi les ravageurs agricoles les plus destructeurs, les genres Anastrepha, Bactrocera et Ceratitis présentant le plus grand risque1. De nombreuses zones présentent un risque élevé d’établissement de mouches exotiques des fruits, d’après 1) les incursions historiques et les programmes de délimitation et d’éradication connexes, 2) le taux élevé d’arrivée de matériel hôte de la mouche des fruits aux points d’entrée et 3) les conditions climatiques favorables à l’établissement de populations reproductrices. L’État de Californie connaît de multiples incursions et détections de téphritidés chaque année2. Il y a eu plus de 200 incursions et programmes d’éradication contre les téphritidés dans le monde au cours du siècle dernier, et cela s’est considérablement accéléré au cours des dernières décennies3. Bien que la grande majorité de ces programmes réussissent à éradiquer la mouche des fruitsenvahissante 3,4, le fardeau économique et environnemental de ces invasions reste élevé et la possibilité d’établissement est toujours présente; un exemple catastrophique récent est l’infection de Bactrocera dorsalis sur le continent africain5.

Au cours des programmes d’urgence sur les mouches des fruits, un effort concerté est fait pour détecter et contrôler les populations reproductrices de l’espèce envahissante. Par exemple, l’État de Floride réagit aux incursions de téphrites en appliquant des trempages de sol (sous la ligne d’égouttage des plantes hôtes fruitières) et en enlevant les fruits hôtes dans un rayon de 200 m autour des sites où se trouvent des femelles et/ou des larves accouplées6. Ces actions et tactiques servent à tuer les larves et les pupes dans le sol et à enlever les œufs et les larves des fruits dans la région. Dans certains programmes d’éradication, une quantité importante de fruits hôtes est enlevée. En 2015, plus de 100 000 kg de fruits ont été détruits lors du programme d’éradication de B. dorsalis en Floride6. Les pertes économiques pour les producteurs et les industries connexes dans la seule zone de quarantaine ont été estimées à plus de 10,7 millions de dollars7.

Pour trouver des larves de téphrites dans les zones de quarantaine, une petite équipe d’entomologistes recueille des fruits hôtes dans un rayon de 200 m autour d’une zone de détection de mouches femelles et coupe et inspecte visuellement chaque fruit à la recherche de larves6. Avec des ressources en personnel limitées et des centaines d’hôtes potentiels, la tâche devient difficile, en particulier dans les zones où la diversité des plantes dans les zones de production commerciale et les cours résidentielles est élevée. En outre, les larves peuvent être manquées lors de la coupe des fruits hôtes. Dans une étude évaluant la coupe des fruits aux points d’entrée, la coupe des fruits s’est avérée moins efficace pour détecter A. suspensa que pour conserver les fruits infestés pendant plusieurs semaines et compter les larves et les pupes trouvées dans le substrat de nymphose8.

Il existe des alternatives à la coupe des fruits pour détecter une infestation 9,10,11,12,13. Par exemple, une flottation de cassonade et une méthode à l’eau chaude sont deux procédures acceptées utilisées pour détecter les mouches occidentales des cerises dans les cerises récoltées 9,10. La méthode de cassonade consiste à placer les fruits broyés dans une solution d’eau sucrée et à collecter les larves qui flottent vers le haut. La méthode de flottaison du sucre brun a été développée spécifiquement pour répondre aux règles réglementaires pour les cerises exportées, qui exigent que les usines de conditionnement surveillent les ravageurs de la mouche des fruits de quarantaine. Il existe également un programme de certification des bleuets approuvé entre les États-Unis et le Canada qui comprend la flottation de l’eau de cassonade, la flottation de l’eau salée ou l’ébullition pour soutenir la phytohygiène14. Lors de l’essai de la précision de la flottation du sucre et de l’eau chaude, les chercheurs ont utilisé la méthode de tamisage pour déterminer combien de larves sont manquées 9,10,11,12,13. Une étude a montré que mélanger des bleuets broyés dans une solution saline et filtrer la solution à travers un filtre à café réutilisable était quatre fois meilleur pour détecter les larves de Drosophila suzukii que pour inspecter visuellement la surface des solutions de sel et de sucre14. De plus, la chromatographie en phase gazeuse a été utilisée pour la détection des larves d’A. suspensa dans les agrumes15. L’applicabilité de ces approches n’a pas été testée dans les enquêtes sur le terrain.

Notre objectif était de développer et de tester une méthode pour trouver des larves de téphrites sur le terrain en utilisant le tamisage et la flottaison de l’eau sucrée. Cette méthode permet une détection plus efficace des mouches des fruits immatures que la méthode traditionnelle de coupe des fruits, ce qui favorise le contrôle rapide des populations reproductrices pendant les programmes d’éradication des mouches des fruits.

Protocol

1. Sélection de fruits Déterminez quels fruits sont disponibles dans la zone à étudier. Sélectionnez le fruit hôte en fonction de la liste des hôtes connus pour les espèces de téphrites cibles. Choisissez des fruits mûrs à chair molle, tels que les mangues, les papayes et la goyave. Les fruits à chair non mûre ou dure, tels que les amandes tropicales, doivent être inspectés avec une méthode différente, telle que la coupe des fruits. Choisissez des fruits tombés, trop mûrs ou mûrs sur les arbres qui présentent des signes de dommages, des cicatrices de ponte et des points mous. Traiter environ 2 L de fruits à la fois (p. ex., 5 goyaves ou 5 mangues de taille moyenne constituent des échantillons adéquats pour cette méthode). Le nombre de fruits pouvant être transformés en même temps dépend de la taille des fruits (Figure 1A). 2. Mushing Coupez les fruits en gros morceaux et placez-les dans un sac de rangement à fermeture à glissière de 4 L (Figure 1B). Ajouter de l’eau dans le sac jusqu’à ce que l’eau recouvre les fruits hachés de 25 à 50 mm (figure 1C). Presser doucement le fruit à la main jusqu’à ce que toute la pulpe se soit détachée de la peau et ait une consistance lisse (c.-à-d. pas de gros morceaux) (figure 1D). 3. Tamis pour la collecte tardive Empiler les tamis. Utilisez de grands tamis (457 mm de diamètre) pour traiter de grandes quantités de fruits (~ 5 fruits à la fois) et des tamis plus petits (305 mm de diamètre) pour des fruits individuels ou des échantillons plus petits (< 5 fruits). Empiler le tamis avec un tamis à grandes mailles (no 8; 2,36 mm) sur un tamis à petites mailles (no 20; 0,85 mm). Pour la détection des étoiles précoces, placer un troisième tamis (no 45; 0,35 mm) au fond de la pile (figure 1E). Verser la pulpe dans le tamis supérieur (Figure 1F). Lavez soigneusement la pulpe à travers la pile de tamis à l’aide de l’eau d’un robinet, d’un tuyau ou d’une bouteille jusqu’à ce que la pâte fine ait traversé les tamis (figure 1G). Balayez visuellement les tamis supérieurs à la recherche de larves à un stade avancé qui auraient pu être retenues avec la peau ou tout gros morceau de fruit (figure 1H). Inspectez soigneusement le deuxième tamis à la recherche de larves à un stade avancé. Avec de grandes quantités de pulpe fine, un rinçage supplémentaire peut être nécessaire. Prélever les larves des tamis avec des pinces larvaires et les placer dans des flacons contenant 70% d’EtOH. 4. Flottation du sucre pour la collecte précoce des stades Prémélanger la solution de sucre en dissolvant 453 g (1 boîte) de sucre brun foncé dans 2 L d’eau du robinet, ce qui donne un indice Brix de 19°10. Lavez la pulpe des tamis à mailles plus fines (p. ex., no 20 et no 45) jusqu’au bord du tamis avec de l’eau du robinet, puis déplacez le matériau vers un récipient en plastique (11 L). Ajouter la solution de cassonade jusqu’à ce qu’elle recouvre la pulpe de 25 à 50 mm et ajouter 2 gouttes d’antimousse. Laisser reposer la pulpe dans la solution de cassonade pendant environ 5 minutes. Recueillir les larves qui flottent à la surface de la solution avec une pince larvaire dans des flacons contenant 70% d’EtOH. 5. Curation larvaire Étiqueter un flacon avec le lieu de collecte, la date, le type de fruit et le collecteur pour un examen et une identification ultérieurs.

Representative Results

Extraction d’Anastrepha suspensa à un stade précoce et tardif à partir de fruits récoltés au champDans cette expérience, nous avons comparé les méthodes de coupe des fruits et de mushing, tamisage et flottaison (MSF) en ce qui concerne la proportion de larves détectées et le temps moyen nécessaire pour les détecter. La goyave, fortement infestée par les larves d’Anastrepha suspensa, a été collectée dans une plante située à l’Université de Floride, Institut des sciences alimentaires et agricoles, Centre de recherche et d’éducation tropicales, Homestead, FL. Les fruits ont été triés au hasard en groupes de 5 et assignés à 1 des 2 méthodes d’extraction larvaire: 1) coupe à la main ou 2) méthode MSF. Le temps nécessaire pour collecter toutes les larves visibles à l’œil nu en utilisant chaque méthode d’extraction a été enregistré. La méthode de coupe à la main a suivi la méthode actuellement utilisée dans un programme d’éradication. Chacun des 5 ouvriers (n = 5) a été assigné à 5 fruits pour rechercher tous les stades des larves en coupant les fruits en plus petits morceaux et en inspectant visuellement la pulpe. Pour déterminer si les larves ont été oubliées lors de l’inspection visuelle, les morceaux de fruits coupés à la main ont été réinspectés à l’aide d’un microscope à dissection (10x). Pour la méthode MSF, 5 fruits ont été coupés en gros morceaux (50-80 cm), placés dans des sacs à fermeture à glissière et pressés doucement à la main jusqu’à ce que toute la pulpe soit délogée de la peau et que la pulpe ait une consistance lisse (c’est-à-dire pas de gros morceaux). Les fruits muets ont été filtrés à travers une série de grands tamis en laiton (45,7 cm). La plus grande maille (n ° 8) était empilée sur le dessus, suivie d’un numéro n ° 20 et d’un tamis n ° 45. Le personnel affecté à ce traitement a lavé la pulpe à travers le treillis à l’aide d’eau provenant d’un tuyau relié à un robinet d’évier. Les larves du stade tardif étaient apparentes dans les tamis. Les plus petites étoiles étaient mélangées à de la pulpe, ce qui les rendait difficiles à voir et à enlever. Par conséquent, le mélange pulpe/larves des tamis a été mis dans des seaux avec 1 L de solution d’eau de cassonade. Les larves ont immédiatement flotté à la surface. La solution a été doucement agitée et, après 5 minutes, les larves ont été retirées des seaux et comptées. Le temps nécessaire pour traiter les fruits était une combinaison de mushing, de tamisage et d’élimination des larves de la solution d’eau sucrée. Les données sur le nombre de larves trouvées par les méthodes de coupe manuelle ou de tamisage et de flottaison ont été analysées à l’aide du test non paramétrique de Kruskal-Wallis (p = 0,05)16. La méthode MSF a produit un plus grand nombre de larves (Figure 2A) et plus de larves par minute (Figure 2B) que la coupe manuelle. Bien que la détection des différentes étoiles n’ait pas été quantifiée dans cette étude, nous avons observé que toutes les étoiles (première, deuxième et troisième) ont été trouvées à l’aide de tamis, alors que seules les étoiles ultérieures (deuxième et troisième) ont été observées à l’aide de la coupe à la main. Lorsque les échantillons précédemment coupés et inspectés visuellement ont été réinspectés avec une lunette de microscope à dissection, 40% des larves de stade avancé infestant les fruits ont été manquées. Cependant, les instars antérieures ont été principalement trouvées lors de la réinspection. Cette expérience a montré que l’utilisation de la méthode MSF est plus efficace et efficiente pour trouver des larves dans les fruits fortement infestés. Cependant, les fruits infestés par un nombre plus faible de larves sont plus susceptibles d’être rencontrés dans un programme d’éradication, où les espèces envahissantes seraient très rares. Par conséquent, nous avons mené une étude en laboratoire dans laquelle le fruit hôte était infesté par un faible nombre connu de larves. Infestation manuelle de mangues et de papayes pour simuler une faible infestation par Bactrocera dorsalisCette expérience a comparé les méthodes de coupe des fruits et de MSF en ce qui concerne la proportion de larves détectées et le temps nécessaire pour les détecter lorsque l’infestation était relativement faible. L’infestation manuelle a été utilisée comme outil expérimental pour évaluer l’efficacité de chaque méthode, car le nombre de larves présentes était connu avec certitude. Un foreur du liège (1,0 cm de diamètre) a été utilisé pour faire 5 trous dans des mangues et des papayes individuelles exemptes de larves de mouches des fruits. Une seule larve de B. dorsalis de la fin du deuxième au début du troisième stade a été placée dans chacun des 5 trous d’un sous-ensemble du fruit. Les trous ont été bouchés à l’aide du morceau percé du fruit et les fruits restants ont été bouchés sans insérer de larve pour simuler visuellement l’infestation manuelle. Les fruits ont été maintenus à 27 °C pendant 48 h pour permettre le développement larvaire. L’expérience a été menée au laboratoire ARS de Hilo, île d’Hawaï (n = 5 travailleurs) et au laboratoire APHIS-PPQ sur l’île d’Oahu, Hawaii (n = 4 travailleurs). Pour la coupe des fruits, chaque ouvrière a reçu 5 mangues (1 infestée de 1 larve et 4 non infestées) et 4 papayes (une infestée et 3 non infestées). Un ouvrier coupait chaque fruit individuellement en morceaux de plus en plus petits et inspectait continuellement la pulpe à la recherche de mouches des fruits immatures. La recherche a été interrompue lorsque la pulpe a été minutieusement inspectée. Le nombre total de larves trouvées et le temps passé par chaque ouvrière à transformer tous les fruits par coupe ont été enregistrés (figure 3) et (figure 4). Chaque ouvrier a reçu un autre ensemble similaire de fruits (5 mangues et 4 papayes) pour le mushing ou le tamisage (sans coupe de fruits), avec 2 morceaux infestés comme décrit précédemment. La pulpe a été versée dans le tamis supérieur et lavée à travers la pile de tamis à l’aide de l’eau d’un robinet et les larves ont été retirées, comme décrit dans le protocole. L’expérience a été menée deux fois, avec flottation du sucre et sans flottaison du sucre, afin de déterminer si le retrait de l’étape de flottaison augmenterait la vitesse du processus sans perdre de sensibilité (c.-à-d. que toutes les larves ou la plupart d’entre elles ont été trouvées) (figure 3). Le nombre de larves trouvées et le temps passé par chaque travailleur à traiter les fruits par la méthode de coupe, MSF ou MS ont été enregistrés. Tant pour les mangues que pour les papayes, la méthode complète de MSF (flottation incluse) a permis d’obtenir un plus grand nombre de détections larvaires et a été plus rapide que la découpe des fruits (tableau 1). Les travailleurs utilisant la méthode traditionnelle de découpe des fruits ont manqué 32 % et 35 % des larves placées dans les mangues et les papayes, respectivement (tableau 1). La transformation des fruits en vrac à l’aide de la technique MSF nécessitait 30 % moins de temps que la découpe de mangues individuelles et 35 % moins de temps que la découpe de papayes individuelles (Figure 3). Plus de larves ont été trouvées par minute en utilisant la méthode MSF pour la papaye (Figure 3C) et la mangue (Figure 3D) par rapport à la méthode de coupe des fruits. Toutes les larves trouvées étaient vivantes. L’identification morphologique larvaire n’est possible que pour les étoiles tardives. Nous avons répété l’expérience ci-dessus, mais nous avons omis la procédure de flottaison pour déterminer si la récupération des larves restait élevée et si la vitesse de transformation des fruits augmentait. La méthode de la SM (avec la flottaison omise) a donné lieu à plus de détections larvaires de papaye (figure 4A) et de mangue (figure 4B) que de coupes et d’inspections visuelles. De plus, la technique était plus rapide que la coupe et l’inspection visuelle de la papaye (Figure 4C) et de la mangue (Figure 4D). La suppression de l’étape de flottaison de la méthode MSF a réduit le temps nécessaire pour trouver les larves à un stade avancé de 90 % pour la papaye et de 48 % pour les mangues (tableau 2). Le pourcentage de larves trouvées était élevé pour les deux méthodes et était systématiquement plus élevé pour la SP (flottaison omise). Pour la papaye, 80 % et 85 % des larves ont été récupérées à l’aide des méthodes MSF et MS, respectivement (tableau 1 et tableau 2). Pour la mangue, 88 % et 95 % ont été récupérés à partir des méthodes MSF et MS, respectivement (Tableau 1 et Tableau 2). Comparaison sur le terrain des méthodes de découpe des fruits et MSFLe but de cette expérience était de comparer les méthodes de coupe des fruits et de MSF dans des conditions de terrain, imitant un programme d’urgence contre les mouches des fruits. La transformation des fruits a été effectuée sans la commodité et l’infrastructure du laboratoire pour tester l’état de préparation au champ des deux méthodes d’extraction larvaire. Les travaux ont été menés dans un verger de goyaves situé à l’unité de recherche sur les ressources génétiques et les maladies phytogénétiques tropicales de l’USDA-ARS près de Hilo. Au total, 40 goyaves présentant des signes d’infestation ont été collectées et divisées en 2 groupes. Au total, 20 goyaves ont été soumises à une inspection de coupe/visuelle suivie de MSF (flottation incluse), ce qui a permis d’évaluer la sensibilité de la méthode de coupe par rapport à la méthode MSF. La dissection s’est déroulée comme décrit ci-dessus. Lorsqu’elles ont été détectées, les larves ont été retirées et comptées. Quatre travailleurs ont disséqué 5 goyaves chacun, et le temps nécessaire à la coupe et à l’inspection a été enregistré pour chaque travailleur. Le MSF post-coupe a été effectué comme ci-dessus, sauf qu’un troisième tamis à mailles plus petites (n ° 40, 0,420 mm) a été utilisé en plus des tamis n ° 8 et n ° 20 pour collecter les larves plus petites. Le deuxième ensemble de 20 goyaves a été placé dans 2 sacs à fermeture à glissière (10 fruits par sac) et a été soumis uniquement à MSF (c’est-à-dire pas de coupe), ce qui a permis de comparer le temps nécessaire à la coupe des fruits par rapport à MSF. Comme ci-dessus, trois tamis ont été utilisés dans cette procédure. Le nombre de larves trouvées et le temps total nécessaire pour traiter les fruits (mushing et maintien des fruits pendant 5 minutes dans le sac/tamisage/flottaison dans une solution de sucre) ont été enregistrés. Comme on l’a constaté en laboratoire, la coupe des fruits sous-estimait l’infestation de fruits et était très variable, détectant 25% à 83% moins de larves que ce qui pouvait être récupéré en utilisant les méthodes MSF (tableau 3). De plus, dans l’échantillon avec un faible nombre de larves, MSF a récupéré 500% de larves en plus, offrant une sensibilité plus élevée au test et une plus grande chance d’identifier l’organisme infestant. Les fruits ont été transformés beaucoup plus rapidement en utilisant la méthode MSF par rapport à la coupe; couper et inspecter 5 fruits nécessitait à peu près le même temps que la transformation de 10 fruits via MSF. Figure 1 : Étapes du protocole d’extraction des larves de mouches des fruits. (A) Traiter environ 2 L en volume de fruits à la fois (p. ex., 5 goyaves ou 5 mangues moyennes constituent des échantillons adéquats pour cette méthode). (B) Coupez les fruits en gros morceaux et placez-les dans un sac de rangement à fermeture à glissière de 4 L. (C) Ajouter de l’eau dans le sac jusqu’à ce que l’eau recouvre les fruits hachés de 25 à 50 mm. (D) Presser doucement le fruit à la main jusqu’à ce que toute la pulpe se soit détachée de la peau et ait une consistance lisse (c.-à-d. pas de gros morceaux). E) Empiler le tamis avec le tamis à grandes mailles (no 8; 2,36 mm) suivi du tamis à petites mailles (no 20; 0,85 mm). Pour les premières étoiles, placez un troisième tamis (n ° 45; 0,35 mm) sur le fond de la pile. (F) Verser la pulpe dans le tamis supérieur. (G) Lavez soigneusement la pulpe à travers la pile de tamis en utilisant l’eau d’un robinet, d’un tuyau ou d’une bouteille jusqu’à ce que la pulpe fine ait traversé le premier tamis. (H) Balayer visuellement les tamis supérieurs à la recherche de larves de stade avancé qui auraient pu être retenues avec la peau ou tout gros morceau de fruit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Extraction d’Anastrepha suspensa au stade précoce et tardif à partir de fruits récoltés au champ. Nombre moyen (± erreur type de la moyenne [ET]) de larves d’Anastrepha suspensa provenant de cinq fruits de goyave collectés par découpe et inspection visuelle (découpe: 70,4 ± 11,9) ou lavage de la pulpe à travers une série de trois tamis suivis d’un trempage de la pulpe dans une solution d’eau sucrée (MSF: 175,6 ± 21,91) (A). Nombre moyen de larves (±ET) collectées par minute à partir de 5 goyaves traitées par bouturage (1,21 ± 0,16) et par MSF (3,71 ± 0,50) (B). Chaque méthode a été répliquée 5 fois, et les astérisques au-dessus des barres indiquent des différences significatives pour le nombre de larves (χ 2 = 6,81, p < 0,01) et le temps de traitement (χ2 = 6,80, p < 0,01) sur la base d’un test de Kruskal-Wallis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Validation de la méthode complète de mushing-tamisage-flottation utilisant une infestation manuelle de mangues et de papayes pour simuler une faible infestation de Bactrocera dorsalis. Nombre moyen de larves de Bactrocera dorsalis (±SE) trouvées dans la papaye (découpage : 3,25 ± 0,51, MSF : 4,0 ± 0,4) (A) et la mangue (coupe : 3,4 ± 0,51, MSF : 4,4 ± 0,4) (B) et le nombre moyen de larves (±SE) collectées par minute sur la papaye (coupe : 0,21 ± 0,1, MSF : 0,4 ± 0,15) (C) et la mangue (coupe : 0,14 ± 0,01, MSF : 0,21 ± 0,03) (D). Fruits transformés à l’aide de la méthode de coupe ou de MSF (flottation incluse, n = 5) infestés manuellement par 5 larves du troisième stade. Les astérisques au-dessus des barres indiquent des différences significatives pour le nombre de larves trouvées dans la papaye (χ 2 = 5,39, p = 0,02) et la mangue (χ2 = 3,94, p = 0,05) par rapport à la découpe des fruits basée sur les tests de Kruskal-Wallis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Validation de la méthode de mushing-tamisage (flottaison enlevée) par infestation manuelle de mangues et de papayes pour simuler une faible infestation par Bactrocera dorsalis. Le nombre moyen de larves (±ET) trouvées dans la papaye (bouture: 1,25 ± 0,48, MS: 4,25 ± 0,48) (A) et la mangue (coupe: 2,5 ± 0,5, MS: 4,75 ± 0,25) (B) et le nombre moyen de larves collectées par minute (±SE) dans la papaye (coupe: 0,15 ± 0,05, MS: 0,76 ± 0,15) (C) et la mangue (coupe: 0,16 ± 0,04, MS: 0,44 ± 0,04) (D). Les fruits ont été infestés manuellement avec 5 larves de Bactrocera dorsalis du troisième stade et traités par découpe et inspection visuelle (coupe) ou broyés dans un sac et lavés à travers des tamis (seulement le mushing et le tamisage, sans flottaison, n = 4). Les astérisques au-dessus des barres indiquent des différences significatives pour le nombre de larves trouvées dans la papaye (χ 2 = 5,46, p = 0,02) et la mangue (χ 2 = 5,25, p = 0,02) et le temps nécessaire pour traiter la papaye (χ 2 = 5,39, p = 0,02) et la mangue (χ 2 = 5,39, p = 0,02) par rapport à la découpe des fruits, sur la base des tests de Kruskal-Wallis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Fruit # Fruits transformés #Larvae ajouté Méthode de traitement #Larvae trouvé Délai de traitement (min)* % de récupération Mangue 25 25 Découpage 17 158 68% Mangue 25 25 MSF 22 113 88% Papaye 16 20 Découpage 13 62 65% Papaye 16 20 MSF 16 40 80% *Temps total total totalisé plus de 5 travailleurs. Tableau 1 : Le nombre de larves récupérées et le temps nécessaire pour transformer les fruits par la méthode de coupe et d’inspection visuelle (coupe) ou par la méthode complète de mushing, tamisage et flottaison (MSF). Le fruit d’essai a été infesté manuellement avec 5 larves du troisième stade mélangées à des fruits forés et coiffés seulement (1 des 5 mangues, 1 des 4 papayes). Fruit # Fruits transformés #Larvae ajouté Méthode de traitement #Larvae trouvé Délai de traitement (min)* % de récupération Mangue 20 20 Découpage 10 66 50% Mangue 20 20 MS 19 44 95% Papaye 16 20 Découpage 5 38 25% Papaye 16 20 MS 17 25 85% *Temps total total totalisé sur 4 travailleurs. Tableau 2 : Nombre de larves récupérées et temps nécessaire pour transformer les fruits par coupe ou mushing et tamisage seulement, flottaison omise (MS). Les fruits d’essai ont été infestés manuellement avec cinq larves du troisième stade mélangées à des fruits forés et coiffés uniquement (1 mangue sur 5, 1 papaye sur 4). Travailleur/méthode #Fruit traitées Temps de traitement (min) #Larvae trouvé la coupe #Larvae trouvé MSF* % du nombre total de larves trouvées par coupe Travailleur 1 : découpe 5 18 33 14 70% Travailleur 2 : découpe 5 18 1 5 17% Travailleur 3 : découpe 5 26 9 11** 75% Travailleur 4 : découpe 5 20 24 Travailleur 5 : MSF 10 22 NA 22 NA Travailleur 6 : MSF 10 18 NA 37 NA * Pâte provenant de la coupe et de l’inspection visuelle traitée à nouveau selon la méthode MSF pour déterminer le nombre de larves manquées à la fin du 2eet 3e stade ** Pulpe de fruits ouvriers 2 et 3 mis en commun avant transformation selon la méthode MSF Tableau 3 : Nombre de larves trouvées dans la goyave récoltée au champ en coupant et en inspectant visuellement le fruit (coupure) ou en mushing, tamisant et flottant (MSF) le fruit.

Discussion

Notre objectif était de développer un moyen efficace de trouver des larves de téphrites sur le terrain. Le lancement d’un programme d’éradication ou l’établissement d’une zone de quarantaine est motivé par la détection de femelles ou de larves accouplées6, ce qui indique une population reproductrice. La méthode actuelle de coupe et de recherche visuelle des fruits est inefficace pour trouver des larves car il y a généralement beaucoup plus de fruits hôtes présents que ce qui peut être inspecté individuellement. En outre, les populations de téphritidés sont probablement faibles dans une zone de nouvelle invasion, ce qui rend les chances de trouver des larves dans une grande quantité de fruits incroyablement difficiles. Par exemple, dans le programme d’éradication de Bactrocera dorsalis en Floride en 2015, 54 espèces hôtes différentes ont été identifiées et plus de 4 000 fruits ont été coupés. Dans ce programme d’éradication, seulement quelques larves ont été trouvées dans la mangue, et aucun autre hôte n’a été trouvé infesté6. Nous avons constaté que la méthode MSF/MS était à la fois plus sensible et plus rapide dans la détection des larves d’A. suspensa et de B. dorsalis lors du traitement de fruits contenant une grande quantité de pulpe (mangues, goyave et papaye) en vrac par rapport à la découpe de fruits. La plus grande quantité de fruits hôtes qu’il est possible d’inspecter à l’aide de la méthode du mushing et du tamisage, combinée à l’augmentation de la détection d’une larve rare, pourrait augmenter la probabilité qu’une infestation soit détectée tôt. La détection précoce d’une population reproductrice pourrait augmenter la probabilité d’éradication et réduire les coûts du programme.

Nos expériences ont montré que le nombre de larves détectées par les ouvrières coupant et inspectant visuellement les fruits variait considérablement. Les travailleurs coupant les fruits ont manqué 50% et 75% des larves de B. dorsalis placées dans les mangues et les papayes, respectivement. En revanche, seulement 5 % et 15 % des larves ont été oubliées en utilisant la méthode MS pour la transformation de la mangue et de la papaye, respectivement. De même, une étude évaluant la coupe des fruits aux points d’entrée a montré qu’il y avait une variation considérable dans le nombre de fruits et de larves infestés trouvés par les inspecteurs8. L’étude a montré que les inspecteurs de port expérimentés ont manqué 64 % à 99 % des larves d’A. suspensa et 16 % à 82 % des fruits infestés lorsque les fruits ont été coupés et inspectés visuellement8. Nos résultats suggèrent que la méthode de mushing et de tamisage pourrait réduire la probabilité qu’un travailleur manque de détecter un fruit infesté.

La flottation du sucre et de l’eau chaude sont des protocoles acceptés dans une méthode d’approche systémique pour s’assurer que les cerises et les bleuets sont exempts de mouches des fruits14. Un sous-ensemble d’un envoi est broyé dans la solution, après quoi un inspecteur examine visuellement la surface de la solution de sucre pour détecter la présence d’œufs et de larves. Bien qu’un plus grand nombre de fruits puisse être transformé par rapport à la coupe de fruits individuels, la probabilité de trouver des larves à l’aide de ces techniques est toujours affectée par la capacité de l’inspecteur, le stade et le nombre de larves présentes, et le type de fruit8. Nous avons constaté que, comme les autres téphritides, B. dorsalis et A. suspensa se délogent de la pulpe du fruit et flottent à la surface. Fait intéressant, nous avons constaté qu’avec des larves plus grandes à un stade avancé, qui sont la cible des programmes d’urgence et d’éradication car elles peuvent être identifiées morphologiquement, y compris la flottation du sucre, n’a pas augmenté la précision de la méthode. En fait, l’ajout de la méthode de flottaison a augmenté le temps de traitement de 90% pour la papaye et de 48% pour la mangue. L’augmentation du temps de traitement et les matériaux supplémentaires (c.-à-d. eau, bacs, sucre, etc.) ne permettent pas d’ajouter cette étape sur le plan opérationnel lors de la recherche de grandes étoiles sur le terrain. La méthode de flottaison du sucre peut être appropriée lorsque l’objectif est de détecter toutes les étapes, y compris les premières stades d’entrée, comme aux points d’entrée et aux stations de conditionnement. La filtration de la solution de sucre avec un tamis à mailles fines fournirait probablement la détection la plus précise des œufs et des premières larvesd’étoiles 11,12.

Les techniques MS et MSF fonctionnent bien avec des fruits qui peuvent facilement être broyés et ont un grand volume de pulpe. Les larves de téphrites ont tendance à s’enfouir dans la pulpe du fruit, ce qui rend la détection visuelle difficile. Un aspect essentiel des méthodes MS et MSF est la séparation des larves de la pulpe. Le processus de tamisage élimine la pulpe, exposant ainsi les larves sur des tamis. De même, la méthode de l’eau sucrée sépare les larves de la pulpe en faisant flotter les larves, tandis que la pulpe coule au fond de la casserole. Les larves séparées de la pulpe par les méthodes MS ou MSF sont facilement observées se déplaçant sur le tamis ou la surface de l’eau. Bien que la méthode de mushing, de tamisage et éventuellement de flottaison ait grandement amélioré la vitesse et la précision de détection des larves de téphrites dans les fruits hôtes importants, le processus peut ne pas convenir à tous les fruits. Par exemple, les fruits hôtes à pulpe dure, tels que les avocats verts ou les fruits avec une grosse graine / noyau et une quantité relativement faible de pulpe, comme les amandes tropicales, peuvent être plus faciles à traiter par coupe manuelle et inspection visuelle.

Nous avons constaté que les méthodes MS et MSF étaient plus rapides lorsqu’un nombre relativement faible de fruits (5-10) étaient transformés. La différence serait probablement plus grande si de plus grandes quantités de fruits étaient transformées, ce qui pourrait être nécessaire et typique des programmes d’urgence contre les mouches des fruits. Le retrait de l’étape de flottaison a encore augmenté la vitesse de détection sans compromettre la précision de la recherche de grandes larves de téphrites (>3 mm). Nous avons montré que ces techniques pouvaient être appliquées sur le terrain, ce qui simulait les conditions rencontrées par les travailleurs lors d’un programme d’urgence contre la mouche des fruits. Nos études indiquent que les méthodes de SP peuvent permettre une détection plus rapide des larves à un stade avancé et l’éradication ultérieure des populations reproductrices de téphrites. MSF pourrait être utilisée pour détecter les œufs et les étoiles précoces qui ne sont actuellement pas ciblés par les programmes d’éradication.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Silvia Durand, Teri Allen, Jose Alegria et Alejandra Canon pour leur aide dans le traitement de la goyave à l’Université de Floride, Rick Kurashima, Jean Auth et Bruce Inafuku pour leur aide dans l’évaluation du fruit artificiellement infesté à Hawaii, et Michael Stulberg pour leurs commentaires utiles sur les versions antérieures du manuscrit. Ce projet a été financé en partie par l’USDA APHIS et l’accord de coopération de l’Université de Floride et soutenu en partie par USDA-ARS (projet 2040-22430-027-00D). Les constatations et les conclusions de cette publication préliminaire n’ont pas été officiellement diffusées par l’USDA et ne doivent pas être interprétées comme représentant une détermination ou une politique de l’organisme. La mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux dans cette publication est uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et n’implique pas une recommandation ou une approbation de la part de l’USDA. L’USDA est un fournisseur et un employeur garantissant l’égalité des chances.

Materials

Anti foamer MicroLubrol ML200-50-4 MicroLubrol 2000 Fluid Pure Silicone Oil, https://www.microlubrol.com
Brown Sugar Dominos 1 lb Box  Dark Brown Sugar Crystals, https://www.dominosugar.com/products/dark-brown-sugar
Cutting Boards KitchenAid KE703NOSMGA KitchenAid Classic Nonslip Plastic Cutting Board, 12×18-Inch, https://www.amazon.com/KitchenAid-Classic-Nonslip-Plastic-11×14-Inch/dp/B09117L774/ref=sxin_24_ac_d_mf_brs?ac_md=2-1-S2l0Y2hlbkFpZA%3D%3D-ac_d_mf_brs_brs&content-id=amzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d%3Aamzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&crid=UXMLNC72BL0
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EthOH Fisher Scientific BP8202500 Ethanol Solution 96%, Molecular Biology Grade, https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-solution-96-molecular-biology-grade-fisher-bioreagents/BP8202500
Glass Vials Fisher Scientific 0333921H Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials With Closures, https://www.fishersci.com/shop/products/class-b-clear-glass-threaded-vials-with-closures-packaged-separately/0333921H
Knives Zyliss 31380 5.25" Utility Knife, https://www.amazon.com/ZYLISS-Utility-Kitchen-5-5-Inch-Stainless/dp/B00421ATJK/ref=sr_1_7?crid=2U27KE1HTG5N1&keywords=
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Soft Forceps DR Instruments DRENTF01 DR Instruments Featherweight Entomology Forceps, https://www.amazon.com/DR-Instruments-DRENTF01-Featherweight-Entomology/dp/B008RBLO8Q
Zipper Lock Storage Bags Ziploc 682254 Ziploc brand 2 gal Clear Freezer Bags, https://www.amazon.com/Ziploc-Freezer-Bag-Gallon-100/dp/B01NCDWR8A/ref=sr_1_1_sspa?crid=3SQFBT64Z76ES&keywords=
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Roda, A. L., Steck, G., Fezza, T., Shelly, T., Duncan, R., Manoukis, N., Carvalho, L., Fox, A., Kendra, P., Carrillo, D. Sieving Fruit Pulp to Detect Immature Tephritid Fruit Flies in the Field. J. Vis. Exp. (197), e65501, doi:10.3791/65501 (2023).
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