イン・ビトロ 発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

注:すべての細胞培養技術は、層流フード内の無菌条件下で実施する必要があり、細胞は5%CO2を含む腐植雰囲気中で37°Cでインキュベートする必要があります。維持(rhbFGF)および分化プロトコル(rhBMP4、rhVEGF、rhbFGF、rhIL6、rhFLT3L、rhIGF1、rhIL11、rhSCF、rhEPO、rhTPO、rhIL3)の両方のためのすべてのサイトカイン調製に関する説明書は 、補足表S1に記載されています。 1. ヒトiPS細胞の培養 – 細胞の融解、維持、凍結 維持培地、成長因子、その他の試薬の調製ヒトES細胞全血清フリー培地サプリメント、25%ウシ血清アルブミン(BSA)36 mL、および55 mMのβ-メルカプトエタノール1 mLをダルベッコ修飾イーグル培地/F12(DMEM/F-12)基礎培地に添加して培地を調製します( 材料表を参照)。 1 mgの Rhoキナーゼ阻害剤 (iRock)を1 mLのDMSOに再懸濁し、50 μLのアリコートを作り、-20°Cで保存します。注:これらのアリコートは、-20°Cで1年間保存できます。解凍後は4°Cで1週間保存できます。 ビトロネクチン(VTN-N)溶液を氷上で解凍し、バイアルあたり60 μLを分注してから、-80°Cで保存します。 プレートをコーティングする直前に、60 μLのストックを6 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で希釈します。最終濃度は 5 μg/mL です。 iPS細胞株の融解注:ヒト多能性幹細胞株SFCi55は、以前は社内で誘導され、さまざまな細胞タイプおよびさまざまな胚系統への分化に広く使用されていました19、20、21、22。6ウェルプレートの1ウェルを1 mLのVTN-N溶液で37°Cで1時間コーティングします。注:インキュベーション後、コーティングされたプレートは4°Cで最大1週間保存できます。 VTN-N溶液を吸引ピペットで吸引し、20 ng/mLのrhbFGFを添加した予熱培地1 mLを添加する(付表S1)。 iPS細胞の入ったバイアルをウォーターバスで素早く解凍し、細胞を5 mLの予熱した培地に移します。 細胞を室温で300 × g で3分間スピンダウンします。 細胞ペレットを 0.5 mL の培地に再懸濁し、20 ng/mL のrhbFGF を添加します。 すでに1 mLの培地を含む1つのコーティングウェルに細胞を移します。 合計1.5 mLの培地で、細胞を含むウェルに5 μLのiRockを加えます。 インキュベーターで細胞を培養し、平日は毎日培地を交換し、細胞をダブルフィードし、通常の2倍の量の培地を細胞に追加して、週末に確実に給餌します。注:細胞はiRockの存在下で24時間のみ増殖します。 iPS細胞の維持と継代20 ng/mLのrhbFGFを添加した新鮮な予熱培地で培地を毎日交換してください。 細胞の濃度が約80%に達したら、通常は週に2回、細胞を継代します。細胞を継代するには、ステップ1.2.1および1.2.2で説明したように、プレートをVTN-Nでコーティングします。 ウェルから培地を細胞で吸引し、DPBSで洗浄します。 DPBSを吸引し、1 mLの解離試薬( 材料表を参照)を添加し、1分間インキュベートします。 解離試薬を吸引し、さらに3分間インキュベートします。プレートを両側で10回しっかりと叩きます。注:解離ステップでは、インキュベーション時間とタッピング手順において、細胞タイプ固有の最適化が必要になる場合があります。 細胞に培地1 mLを加え、パスツールピペットで培地で一度洗浄し、ほとんどのコロニーが確実に回収されるようにします。 各ウェルに150 μLの細胞懸濁液を添加し、1ウェルから6ウェルへの継代比を求めます。注:新しいバイアルを融解した直後は、1:1または2継代で1:1または2継代などの低い比率で細胞を継代し、1:6の比率で継代する前に安定した増殖段階に達するようにすることをお勧めします。 インキュベーターで細胞を培養し、平日は毎日培地を交換し、週末に一度細胞をダブルフィードします。 iPS細胞株の凍結注:融解後、最初の2継代以内で細胞を凍結し、培養を開始するために凍結バイアルの低継代バッチを一定に維持します。細胞のコンフルエント度が約80%に達したら凍結します。培地を、20 ng/mL の rhbFGF と 5 μL の iRock を添加した新鮮な予熱培地に変更し、少なくとも 1 時間インキュベートします。 手順1.3.2.2-1.3.2.5の説明に従ってセルをデタッチします。 剥離した細胞を、5 mLの培地が入った15 mLの遠心チューブに回収します。 室温で300× g で3分間遠心分離します。 上清を吸引し、凍結保存液1 mLを加えます( 材料表参照)。 パスツールピペットを使用して、細胞を静かに上下にピペットし、凍結保存液中で混合します。メモ:過度なピペッティングは避けてください。これにより、細胞クラスターが解離するおそれがあります。 細胞懸濁液をそれぞれ0.5 mLの2つの凍結保存バイアルに分けます。 凍結保存バイアルを4°Cで予冷した凍結保存容器に移します。 細胞の入った容器を-80°Cの冷凍庫に24時間移してから、バイアルを液体窒素に移して長期保存します。 2. iPS細胞の内皮細胞への分化 分化培地、サイトカイン、成長因子の調製表1に従って無血清分化培地(SFD)を調製する。この培地は、分化の0日目から5日目まで使用してください。 34 SFM基礎培地に34栄養サプリメントと5 mLのL-グルタミンサプリメントを添加して、CD34+ 細胞用の無血清培地(SFM-34)を調製します( 材料表を参照)。この培地は、分化の6日目以降に使用してください。 1 mg のCHIR99021を 716 μL の DMSO に再懸濁し、3 mM の溶液を得ます。完全に再懸濁するまで室温でインキュベートします。必要に応じて、37°Cですばやくウォームアップします。 20 μLのアリコートを作成し、-20°Cで最大6か月間保存します。解凍後はすぐに使用し、再度凍結したり保管したりしないでください。 補足表S1の指示に従ってサイトカインを再懸濁する。すべてのサイトカインのアリコートを-80°Cで保存します。 内皮細胞の分化注:分化の各日について、に記載されているサイトカインの混合物に従って、予熱したSFD培地18 mL(培地/ウェル)を調製します。 表 2.0日目-胚様体(EB)の形成表2に従って、18 mLのSFD培地とMix 1サイトカインを、各6ウェルプレート(3 mL/ウェル)に調製します。 2 mLの予熱したSFD培地とミックス1サイトカインを、撥細胞性6ウェルプレートの各ウェルに加えます( 材料表を参照)。 EB を形成するには、ステップ 1.3.2.2-1.3.2.4 で説明されている手順に従います。注:分化を開始するには、iPS細胞が70〜80%コンフルエントであることを確認してください。 1 mLの予熱したSFD培地とミックス1サイトカインを、分離した細胞クラスターの各ウェルに加えます。 パスツールピペットを使用して、細胞クラスターを1:1の比率でEB形成用の撥細胞ウェルの1つのウェルに静かに移します。 プレートをインキュベーターに入れた後、プレートを前後左右に動かして、EBをウェルに均等に分散させます。 1日目 – EBへの中程度の変化注:このステップは、分化の1日目までに、EBと並んで懸濁液中の単一細胞が多数ある場合にのみ必要です。表2に従って、18 mLのSFD培地とMix 1サイトカインを、各6ウェルプレート(3 mL/ウェル)に調製します。 EBでプレートを回転させて中央に移動させ、パスツールピペットを使用して15 mLの遠心チューブに回収します。注:EBがひも状に凝集しているように見える場合は、15 mL遠心チューブに集める前に、P1000でピペッティングして分離してください。 EBがチューブの底に落ち着くまで5〜10分待ちます。注:EBが小さすぎる場合は、100 × g で5分間遠心分離して沈降させます。 細胞撥水プレートを滅菌水またはDPBSで洗浄し、単一の細胞や破片を取り除きます。 EBから上清を抜き取らずに、慎重かつゆっくりと吸引します。 2 mLのSFDとMix 1サイトカインを、撥細胞プレートの各ウェルに加えます。 1 mL の SFD 培地と Mix 1 サイトカインを使用して、各開始ウェルに EB を再懸濁します – 6 ウェルプレートの場合は、6 mL の培地を追加します。 すでに 2 mL の SFD 培地を含むウェルあたり 1 mL の容量で EB を撥細胞プレートに移します。 プレートをインキュベーターに入れた後、プレートを前後左右に動かして、EBをウェルに均等に分散させます。 2日目 – CHIR99021の追加EBをプレートの中央に渦巻きさせ、ウェルの側面に 表2 に従ってCHIR99021を加えて、細胞との直接接触を避けます。メモ:1日目に培地を交換しなかった場合は、CHIRのみを追加するのではなく、培地全体を交換してください。 表 2 に従って Mix 2 で SFD 培地 18 mL を調製し、各 6 ウェルプレート(3 mL/ウェル)を調製します。 プレートをインキュベーターに入れた後、プレートを前後左右に動かして、EBをウェルに均等に分散させます。 3日目 – EBのミディアムチェンジとMix 3サイトカインの添加表2に従って3つのサイトカインを混ぜ合わせたSFD培地18 mLを、各6ウェルプレート(3 mL/ウェル)に調製します。 ステップ 2.2.2.2-2.2.2.4 の説明に従って EB を収集します。 予熱した2 mLのSFD培地とMix 3サイトカインを撥細胞プレートに加えます。 EBから上清を注意深く吸引します。1 mL/ウェルのSFDをMix 3サイトカインで添加します。 ステップ2.2.2.8-2.2.2.9の説明に従って、ウェル間でEBを分配します。 6日目 – SFM-34の培地交換とMix 4サイトカインの追加表2に従って4つのサイトカインを混ぜ合わせたSFD培地18 mLを、各6ウェルプレート(3 mL/ウェル)に調製します。 ステップ 2.2.2.2-2.2.2.4 の説明に従って EB を収集します。 2 mLの予熱したSFM-34培地とミックス4サイトカインを撥細胞プレートに加えます。 EBから上清を注意深く吸引します。SFM-34 を 1 mL/ウェルと Mix 4 サイトカインで添加します。 ステップ2.2.2.8-2.2.2.9の説明に従って、ウェル間でEBを分配します。 3. CD34+ 細胞の単離とチップへの播種 注:CD34+ 細胞は、モノクローナルマウス抗体、抗ヒトCD34抗体、およびFcRブロッキング試薬(ヒトIgG)に結合したCD34マイクロビーズを含むCD34マイクロビーズキット( 材料表を参照)を用いたポジティブ単離アプローチによって単離されます。フローサイトメトリー解析では、単離の前後に細胞を染色してカラム単離の効率を検証することが重要です。 材料と試薬を準備します。5 mL の 5% BSA 溶液と 200 μL の EDTA 0.5 M から 45 mL の DPBS を加えて洗浄バッファーを調製し、PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA を得ます。分離ごとに新鮮なものを準備し、ろ過滅菌し、使用するまで冷蔵保管してください。 rhLaminin 521 を DPBS Ca 2+ Mg2+ で 1:50 に希釈して調製したラミニン溶液で流体チップをコーティングします。各チップに使用中のチップに適した容量をコーティングし、播種前にインキュベーターで2時間インキュベートします。注:コーティングには他のマトリックスを使用することもできますが、特定の細胞タイプ/実験でテストする必要があります。 表2に従って、SFM-34培地18 mLにMix 4サイトカインを添加してMix 4 SFM-34培地を調製し、ガス交換を容易にするために蓋を少し緩めてインキュベーター内の50 mLチューブに入れます。 選択した灌流セットとインキュベーターで使用するその他のチューブを配置して脱気します。 8日目 – EBの解離とCD34+ の単離ステップ 2.2.2.2-2.2.2.5 の説明に従って EB を収集します。 回収したEBのスタートウェルごとに1 mLの細胞解離試薬を添加します(6ウェルを回収した場合は、6 mLを追加します)。 細胞解離試薬中の EB 懸濁液 1 mL を、細胞忌避プレートの各ウェルに移します。 インキュベーターで10分間インキュベートします。 EBをP1000でウェルに対して10回以内で静かに上下にピペットで固定します。 手順3.2.4-3.2.5.を合計3回繰り返します。注:EBの解離が困難な場合は、上記の手順を合計4回繰り返します。 解離したEBの各ウェルに5 mLの洗浄バッファーを添加します。 細胞を40 μmのストレーナーに通し、50 mLの遠心チューブに集めます。細胞懸濁液を10 μL採取して、細胞をカウントします。注:単離の効率をテストするには、105 細胞/チューブを、後でフローサイトメトリーに使用する2つの異なるチューブ(未染色コントロールおよび事前ソートされたテストサンプル)に移します(ステップ4.3.9-4.3.13で説明)。6ウェルプレートの場合、ろ過後に~106個の細胞 を回収する必要があります。 細胞を300 × gで10分間スピンダウンします。 細胞を300 μLの洗浄バッファーに再懸濁し、ピペッティングを数回静かに行い、凝集液がないことを確認します。製造元のプロトコルに従ってください( 材料表を参照)。 流体チップへのCD34+ 細胞播種注:プロトコルで使用される流体チップは、チャネルの高さが0.6 mm、長さが50 mmで、総成長面積は2.5 cm2 です(補足図S1)。このタイプのチップは、150μLの細胞懸濁液の総量で播種されます。 異なるチップを使用することができ、播種の量と細胞密度は増殖領域に応じて適合させる必要があります。使用する細胞株とその増殖に応じて、追加の最適化が必要になる場合があります。単離したCD34+ 細胞を、Mix 4サイトカインを含む予熱したSFM-34培地300 μLに再懸濁します。 10 μLの細胞懸濁液を採取し、細胞をカウントします。 SFM-34を添加した150 μLの最終容量で2.5×105 細胞を再懸濁します。0.5 μL の iRock を添加します。注:単離の効率をテストするには、105 細胞/チューブを、後でフローサイトメトリーに使用するチューブ(ソート後のテストサンプル)に移します(ステップ4.3.9-4.3.13で説明)。 P200の先端をチャネルの端にあるリザーバー内に置いて、流体チップからラミニンをゆっくりと吸引します。注意: 液体の収集が難しい場合は、チップの片側をゆっくりと持ち上げて、液体が反対側のリザーバーに移動するのを助けます。 細胞懸濁液をチャネルに着実に加えて、気泡が形成されないことを確認します。注意: 手順3.3.4〜3.3.5をすばやく静かに実行して、ラミニンの乾燥とチップのチャネルでの気泡の形成を防ぎます。気泡が形成された場合は、チップの片側を持ち上げ、スライドを軽くたたいて気泡を動員します。貯水池に到達すると、空気界面に上昇し、チャネルに入ることができないはずです。 チップをインキュベーターに移し、細胞がチャネルに完全に付着して細長く見えるように一晩放置します。 細胞が完全に付着したら、ステップ3.3.4と同様に培地を吸引し、サイトカインを添加したSFM-34 200 μLと交換します。 これ以降は、細胞が90%〜100%の濃度に達するまで、毎日培地を交換してください。 4. 内皮細胞への連続フローの応用 – Aorta-on-a-chip 材料と試薬を準備します。表2に従って、18 mLのSFM-34培地にMix 4サイトカインを添加してMix 4 SFM-34培地を調製し、ガス交換を容易にするために蓋を少し緩めてインキュベーター内の50 mLチューブに入れます。 選択した灌流セットと流路系セットアップに使用するチューブをインキュベーターに入れて脱気します。 流体システムアセンブリ灌流セットをメーカーのプロトコルに従ってユニットに取り付けます。メモ: システムには必ずクランプを使用してください。このステップでスライドクランプを使用する場合は、チップに接続する前にチューブ上でスライドさせる必要があります。 新しい流路チップを取り付け、サイトカインを添加したSFM-34培地を添加し、フード内の無菌条件下で両方のリザーバーを満たします。 気泡除去プログラムとキャリブレーションステップを実行します。 セットが接続された流体ユニットをインキュベーターから取り外し、フードに移します。インキュベーターから細胞を含むチップも取り出します。 テストチップの両側にチューブをクランプします。 テストチップからチューブを取り外します。注意: チューブの端にあるルアーコネクタに気泡がないことを確認してください。気泡が見える場合は、P200ピペットを使用して気泡を慎重に吸引し、必要に応じて培地を追加して、コネクタが培地で満たされていることを確認します。 セルを含むチップをチューブに接続します。 クランプを取り外すか開きます。 システムをインキュベーターに移し、エアポンプを流体ユニットに接続します。 ポンプ専用ソフトウェア(補足図S2)を使用して、 表3に示すせん断応力を徐々に増加させて、事前に選択したプログラムを開始します。注:必要な特定の実験によっては、刺激プログラムを最適化する必要がある場合があります。ここで説明するのは、胎児循環の開始時に背側大動脈の壁が経験すると計算されたせん断応力を模倣した、5 dyn/cm2の最終値につながる漸進的なせん断応力の増加 である9。使用される最終的なせん断応力とは無関係に、セルがチップから剥離することなく力に適応できるように、時間の経過とともに徐々に増加させる必要があります。選択した刺激プロトコルが3日を超える場合は、通常18 mLに添加されるMix 4サイトカインを含むSFM-34を1 mL添加して、サイトカインをシステムに補充する必要があります。これを行うには、ポンププログラムを速やかに停止し、500 μLの添加培地を流路セット内の2本のシリンジのそれぞれに加えます。 解析用細胞採取解離バッファーをウォーターバスで予温します。 インキュベーターから流体ユニットを取り外し、フードに移動させます。 チップの両側にあるチューブをクランプし、チップのリザーバーからチューブを取り外します。 チップから培地を静かに取り出し、DPBS Ca 2+ Mg2+と交換して細胞を洗浄します。注:PBSで洗浄するこのステップは、細胞が剥離し始めたらスキップできます。 150 μLの解離バッファーを静かに添加し、37°Cで3分間インキュベートします。注:細胞が単一で分離しているかどうかを顕微鏡で確認してください。それ以外の場合は、さらに2分間インキュベートします。チップはピペッティングによる細胞の剥離を補助することができないため、培地を吸引する前に細胞をチャネルから完全に剥離することが不可欠です。細胞を剥離するために、トリプシンやEDTAベースの緩衝液など、他の溶液を採用することができます。 1つのリザーバーから細胞を含む解離バッファーを回収し、15mLの遠心分離管に移し、DPBSでチャネルを1回洗浄して、分離したすべての細胞を回収します。 細胞の入った15 mLチューブに1 mLの洗浄バッファーを加え、10 μLを取って細胞をカウントします。 細胞懸濁液をフローサイトメトリーチューブで分割し、試験管あたり10〜5 個の細胞を持つようにします。 チューブを300 × gで5分間回転させます。 染色する試験管ごとに50μLになるように染色液を調製します。CD34 PerCP-efluor710またはCD34-PEをそれぞれ1:100および1:200希釈で添加します。 細胞を50 μLの染色液に再懸濁し、4°Cで30分間インキュベートします。 2 mLの洗浄バッファーを添加して細胞を洗浄し、300 × gで5分間泳動します。 ペレットを100 μLの染色液に再懸濁し、フローサイトメーターを使用してデータを取得します。注:細胞は、150 μL の RNA 溶解バッファーを使用して RNA 抽出のためにチップ内で直接溶解したり、DPBS 中の 4% パラホルムアルデヒドを使用して室温で 10 分間イメージング用に固定したりすることもできます。 細胞配向解析画像を解析し、FIJI23 (補足図S3)を用いて細胞配向の変化を定量化します。[分析] |ツール |ROIマネージャーメニュー。 多角形選択ツールを使用してセルの等高線を手動で描画し、[追加] をクリックするか、CTRL+T ショートカットを使用して、ROI マネージャーに追加します。 各 ROI の方向を測定するには、[ 分析] |[測定 ]メニューを設定します。 測定値をすべての ROI に適用します 。 ROIマネージャーのマルチメジャーコマンド。注: この手順では、各 ROI に楕円を当てはめ、長楕円軸と短楕円軸の長さと角度を含むテーブルを生成します。 テーブルをCSVファイルにエクスポートして、他のソフトウェアにインポートしてプロットします。注: プロットに使用されるスクリプトは、https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf8850ddcです。