In vitro Modèle de vaisseau humain fœtal sur puce pour étudier la mécanobiologie du développement

REMARQUE : Toutes les techniques de culture cellulaire doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire et les cellules doivent être incubées à 37 °C dans une atmosphère humifiée avec 5 % de CO2. Les instructions pour toutes les préparations de cytokines à la fois pour l’entretien (rhbFGF) et pour le protocole de différenciation (rhBMP4, rhVEGF, rhbFGF, rhIL6, rhFLT3L, rhIGF1, rhIL11, rhSCF, rhEPO, rhTPO, rhIL3) se trouvent dans le tableau supplémentaire S1. 1. Culture des hiPSC – décongélation, entretien et congélation des cellules Préparation du milieu d’entretien, des facteurs de croissance et d’autres réactifsPréparer le milieu de culture en ajoutant le supplément de milieu sans sérum hESCs entier, 36 mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 25 % et 1 mL de 55 mM de β-mercaptoéthanol au milieu basal Eagle Medium/F12 (DMEM/F-12) de Dulbecco (voir le tableau des matériaux). Remettre en suspension 1 mg d’inhibiteur de la Rho kinase (iRock) dans 1 mL de DMSO, faire des aliquotes de 50 μL et les conserver à -20 °C.NOTE : Ces aliquotes peuvent être conservées à -20 °C pendant 1 an. Une fois décongelés, ils peuvent être conservés à 4 °C pendant 1 semaine. Décongeler la solution de vitronectine (VTN-N) sur de la glace et aliquote 60 μL par flacon avant de la conserver à -80 °C. Juste avant d’enrober les plaques, diluer le bouillon de 60 μL dans 6 mL de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco ; la concentration finale de 5 μg/mL. Décongélation de lignées cellulaires hiPSCNOTE : La lignée de cellules souches pluripotentes humaines SFCi55 a déjà été dérivée en interne et largement utilisée pour la différenciation en divers types cellulaires et différentes lignées embryonnaires 19,20,21,22.Enduire un puits d’une plaque à 6 puits avec 1 mL de solution de VTN-N pendant 1 h à 37 °C.REMARQUE : Après incubation, les plaques revêtues peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à 1 semaine. Aspirer la solution de VTN-N à l’aide d’une pipette d’aspiration et ajouter 1 mL de milieu de culture préchauffé complété par 20 ng/mL de rhbFGF (tableau supplémentaire S1). Décongeler rapidement le flacon contenant les hiPSC au bain-marie et transférer la cellule dans 5 mL de milieu de culture préchauffé. Faites tourner les cellules pendant 3 min à 300 × g à température ambiante. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 0,5 mL de milieu de culture complété par 20 ng/mL de rhbFGF. Transférer les cellules dans un puits enrobé contenant déjà 1 mL de milieu. Ajouter 5 μL d’iRock dans les puits contenant les cellules dans un total de 1,5 mL de milieu. Cultivez les cellules dans l’incubateur, changez le milieu tous les jours pendant la semaine et nourrissez deux fois les cellules, en ajoutant deux fois le volume normal de milieu aux cellules pour assurer l’alimentation pendant le week-end.REMARQUE : Les cellules sont cultivées en présence d’iRock pendant 24 h seulement. Maintenance et transmission des hiPSCChangez le milieu tous les jours avec un milieu de culture frais préchauffé complété par 20 ng/mL de rhbFGF. Passage des cellules lorsqu’elles atteignent environ 80 % de confluence, généralement deux fois par semaine.Pour faire passer les cellules, enduisez une plaque de VTN-N comme décrit précédemment aux étapes 1.2.1 et 1.2.2. Aspirez le milieu des puits avec des cellules et lavez-les avec du DPBS. Aspirer le DPBS et ajouter 1 mL de réactif de dissociation (voir tableau des matériaux) et incuber pendant 1 min. Aspirer le réactif de dissociation et incuber pendant 3 minutes supplémentaires. Tapotez fermement l’assiette 10 fois de chaque côté.REMARQUE : L’étape de dissociation peut nécessiter une optimisation spécifique au type de cellule dans le temps d’incubation et la procédure de taraudage. Ajouter 1 mL de milieu de culture dans les cellules et, à l’aide d’une pipette Pasteur, laver une fois avec le milieu pour s’assurer que la plupart des colonies sont recueillies. Ajouter 150 μL de la suspension cellulaire à chaque puits pour obtenir un rapport de passage de 1 puits dans 6.REMARQUE : Immédiatement après la décongélation d’un nouveau flacon, il est préférable de faire passer les cellules à un rapport plus faible tel que 1 :1 ou 1 :2 pour un ou deux passages afin de leur permettre d’atteindre une phase de croissance régulière avant de passer à un rapport de 1 :6. Cultivez les cellules dans l’incubateur, changez le milieu tous les jours pendant la semaine et nourrissez les cellules une fois pendant le week-end. Congélation de lignées cellulaires hiPSCsREMARQUE : Congeler les cellules dans leurs deux premiers passages après la décongélation pour s’assurer de maintenir un lot constant de flacons congelés à faible passage pour commencer la culture. Congelez les cellules lorsqu’elles atteignent une confluence d’environ 80 %.Remplacer le milieu par un milieu de culture frais préchauffé complété par 20 ng/mL de rhbFGF et 5 μL d’iRock et incuber pendant au moins 1 h. Détachez les cellules comme décrit aux étapes 1.3.2.2-1.3.2.5. Prélever les cellules détachées dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 5 mL de milieu de culture. Centrifuger pendant 3 min à 300 × g à température ambiante. Aspirer le surnageant et ajouter 1 mL de solution de cryoconservation (voir Tableau des matériaux). À l’aide d’une pipette Pasteur, pipetez doucement les cellules de haut en bas pour les mélanger à la solution de cryoconservation.REMARQUE : Évitez le pipetage excessif, qui pourrait entraîner la dissociation des grappes de cellules. Divisez la suspension cellulaire dans deux flacons de cryoconservation de 0,5 ml chacun. Transvaser les flacons de cryoconservation dans un récipient de cryoconservation prérefroidi à 4 °C. Transférez le récipient contenant les cellules dans un congélateur à -80 °C pendant 24 h avant de transférer les flacons dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme. 2. Différenciation des hiPSC en cellules endothéliales Préparation du milieu de différenciation, des cytokines et des facteurs de croissancePréparer le milieu de différenciation sans sérum (SFD) conformément au tableau 1. Utilisez ce support du jour 0 au jour 5 de différenciation. Préparer un milieu sans sérum pour les cellules CD34+ (SFM-34) en ajoutant 34 suppléments nutritifs et 5 mL de L-glutamine au milieu de base 34 SFM (voir le tableau des matériaux). Utilisez ce support à partir du 6e jour de différenciation. Remettre en suspension 1 mg de CHIR99021 dans 716 μL de DMSO pour obtenir une solution de 3 mM. Incuber à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit complètement remis en suspension ; si nécessaire, réchauffez-vous rapidement à 37 °C. Fabriquez des aliquotes de 20 μL et conservez-les à -20 °C jusqu’à 6 mois. Utiliser immédiatement après la décongélation et ne pas congeler à nouveau ou stocker. Remettre les cytokines en suspension conformément aux instructions du tableau supplémentaire S1. Conserver toutes les aliquotes des cytokines à -80 °C. Différenciation des cellules endothélialesREMARQUE : Pour chaque jour de différenciation, préparer 18 mL (3 mL milieu/puits) de milieu SFD préchauffé, selon les mélanges de cytokines décrits dans la section Tableau 2.Jour 0 – formation des corps embryoïdes (EB)Préparer 18 mL de milieu SFD avec Mélanger 1 cytokine selon le tableau 2, pour chaque plaque de 6 puits (3 mL/puits). Ajouter 2 mL de milieu SFD préchauffé avec Mélanger 1 cytokine dans chaque puits d’une plaque à 6 puits répulsif pour cellules (voir le tableau des matériaux). Pour former des EB, suivez les étapes décrites aux étapes 1.3.2.2 à 1.3.2.4.REMARQUE : Assurez-vous que les hiPSC sont confluents à 70-80% pour commencer la différenciation. Ajouter 1 mL de milieu SFD préchauffé avec des cytokines Mix 1 dans chaque puits d’amas de cellules détachées. À l’aide d’une pipette de Pasteur, transférez délicatement les amas de cellules dans un seul puits de répulsif cellulaire pour la formation d’EB dans un rapport de 1 :1. Après avoir placé la plaque dans l’incubateur, déplacez-la vers l’avant et vers l’arrière, à droite et à gauche, pour disperser les EB uniformément dans le puits. Jour 1 – Modification moyenne des EBREMARQUE : Cette étape n’est nécessaire que si, au jour 1 de la différenciation, il y a beaucoup de cellules individuelles en suspension à côté des EB.Préparer 18 mL de milieu SFD avec Mélanger 1 cytokine selon le tableau 2, pour chaque plaque de 6 puits (3 mL/puits). Faites tourner la plaque avec les EB pour les déplacer vers le centre et collectez-les à l’aide d’une pipette Pasteur dans un tube à centrifuger de 15 ml.REMARQUE : Si les EB semblent agglomérés comme dans les cordes, séparez-les en les pipetant de haut en bas avec un P1000 avant de les recueillir dans le tube à centrifuger de 15 ml. Attendez 5 à 10 minutes pour que les EB se déposent au fond du tube.REMARQUE : Si les EB sont trop petits, centrifugez-les pendant 5 min à 100 × g pour les aider à se déposer. Lavez les plaques anticellulaires avec de l’eau stérile ou du DPBS pour éliminer les cellules ou les débris. Aspirez soigneusement et lentement le surnageant des EB sans les déloger. Ajouter 2 mL de SFD avec des cytokines Mix 1 dans chaque puits des plaques répulsives cellulaires. Remettre les EB en suspension à l’aide de 1 mL de milieu SFD avec Mix 1 cytokines pour chaque puits de départ – pour une plaque à 6 puits, ajouter 6 mL de milieu. Transférez les EB dans les plaques répulsives cellulaires dans un volume de 1 mL par puits, qui contient déjà 2 mL de milieu SFD. Après avoir placé la plaque dans l’incubateur, déplacez-la vers l’avant et vers l’arrière, à droite et à gauche, pour disperser les EB uniformément dans le puits. Jour 2 – ajout de CHIR99021Faites tourbillonner les EB au centre de la plaque et ajoutez CHIR99021 selon le tableau 2 sur le côté du puits pour éviter tout contact direct avec les cellules.REMARQUE : Si le milieu n’a pas été changé au jour 1, remplacez le milieu entier au lieu d’ajouter CHIR seul. Préparer 18 mL de milieu SFD avec le mélange 2 selon le tableau 2, pour chaque plaque de 6 puits (3 mL/puits). Après avoir placé la plaque dans l’incubateur, déplacez-la vers l’avant et vers l’arrière, à droite et à gauche, pour disperser les EB uniformément dans le puits. Jour 3 – modification moyenne des EB et ajout de cytokines du mélange 3Préparer 18 mL de milieu SFD avec Mélanger 3 cytokines selon le tableau 2, pour chaque plaque de 6 puits (3 mL/puits). Collectez les EB comme décrit aux étapes 2.2.2.2 à 2.2.2.4. Ajouter 2 mL de milieu SFD préchauffé avec les cytokines Mix 3 dans les plaques répulsives cellulaires. Aspirer soigneusement le surnageant des EB. Ajouter 1 mL/puits de SFD avec Mix 3 cytokines. Répartissez les EB entre les puits comme décrit aux étapes 2.2.2.8 à 2.2.2.9. Jour 6 – changement de milieu pour SFM-34 et ajout de cytokines du mélange 4Préparer 18 mL de milieu SFD avec Mélanger 4 cytokines selon le tableau 2, pour chaque plaque de 6 puits (3 mL/puits). Collectez les EB comme décrit aux étapes 2.2.2.2 à 2.2.2.4. Ajouter 2 mL de milieu SFM-34 préchauffé avec les cytokines Mix 4 dans les plaques répulsives cellulaires. Aspirer soigneusement le surnageant des EB. Ajouter 1 mL/puits de SFM-34 avec le mélange de 4 cytokines. Répartissez les EB entre les puits comme décrit aux étapes 2.2.2.8 à 2.2.2.9. 3. Isolement et ensemencement des cellules CD34+ dans la puce REMARQUE : Les cellules CD34+ sont isolées par une approche d’isolement positif à l’aide d’un kit de microbilles CD34 (voir le tableau des matériaux), qui contient des microbilles CD34 conjuguées à des anticorps monoclonaux de souris, à des anticorps anti-CD34 humains et à un réactif bloquant FcR (IgG humaines). Il est important de valider l’efficacité de l’isolement de la colonne en colorant les cellules avant et après l’isolement pour l’analyse par cytométrie en flux, ci-dessous il est indiqué quand les cellules doivent être prélevées pour cette analyse. Préparer les matériaux et les réactifs.Préparer le tampon de lavage en ajoutant 5 mL de solution BSA à 5 % et 200 μL d’EDTA 0,5 M à 45 mL de DPBS pour obtenir PBS + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA. Préparez-les frais pour chaque isolement, filtrez-stérilisez et conservez-les au réfrigérateur jusqu’à utilisation. Enrober les copeaux fluidiques d’une solution de laminine préparée en diluant la rhLaminin 521 1 :50 dans du DPBS Ca 2+ Mg2+. Enrober chaque copeau avec le volume approprié pour la puce utilisée et incuber dans l’incubateur pendant 2 h avant le semis.REMARQUE : D’autres matrices peuvent être utilisées pour le revêtement et doivent être testées pour le type de cellule/expérience spécifique. Préparez le milieu Mix 4 SFM-34 en complétant 18 mL de milieu SFM-34 avec les cytokines Mix 4 selon le tableau 2 et placez le mélange dans un tube de 50 mL dans l’incubateur avec le couvercle légèrement dévissé pour faciliter les échanges gazeux. Placez les kits de perfusion sélectionnés et tout autre tube à utiliser dans l’incubateur pour dégazer. Jour 8 – dissociation des EB et isolement de CD34+Collectez les EB comme décrit aux étapes 2.2.2.2 à 2.2.2.5. Ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire par puits de départ d’EB prélevés (si 6 puits ont été collectés, ajouter 6 mL). Retransférer 1 mL de la suspension EB dans le réactif de dissociation cellulaire dans chaque puits de la plaque répulsive cellulaire. Incuber pendant 10 min dans l’incubateur. Pipeter doucement les EB de haut en bas contre le puits avec un P1000, pas plus de 10 fois. Répétez les étapes 3.2.4 à 3.2.5 pour un total de 3x.REMARQUE : Si les EB sont difficiles à dissocier, répétez les étapes ci-dessus 4 fois au total. Ajouter 5 mL de tampon de lavage pour chaque puits d’EB dissociés. Recueillir les cellules dans un tube à centrifuger de 50 ml en les faisant passer à travers une crépine de 40 μm. Prélever 10 μL de la suspension cellulaire pour compter les cellules.REMARQUE : Pour tester l’efficacité de l’isolement, transférer 105 cellules/tube dans deux tubes différents (échantillon témoin non coloré et échantillon d’essai prétrié) qui seront utilisés ultérieurement pour la cytométrie en flux (comme décrit aux étapes 4.3.9 à 4.3.13). Pour une plaque à 6 puits, ~10cellules de 6 doivent être collectées après filtration. Faites tourner les cellules pendant 10 min à 300 × g. Remettre les cellules en suspension dans 300 μL de tampon de lavage, en pipetant doucement plusieurs fois pour s’assurer qu’il n’y a pas de grumeaux. Continuez à suivre le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux). Ensemencement de cellules CD34+ dans des puces fluidiquesNOTA : La puce fluidique utilisée dans le protocole a une hauteur de canal de 0,6 mm et une longueur de 50 mm, pour une surface de croissance totale de 2,5cm2 (figure supplémentaire S1). Ce type de puce est ensemencé avec un volume total de suspension cellulaire de 150 μL. Différentes puces peuvent être utilisées, et le volume d’ensemencement et la densité cellulaire doivent être adaptés en fonction de la zone de croissance. Une optimisation supplémentaire peut être nécessaire en fonction de la lignée cellulaire utilisée et de sa croissance.Remettre en suspension les cellules CD34+ isolées dans 300 μL de milieu SFM-34 préchauffé avec des cytokines Mix 4. Prélevez 10 μL de la suspension cellulaire et comptez les cellules. Remettre en suspension 2,5 × 105 cellules dans un volume final de 150 μL complété par SFM-34 ; ajouter 0,5 μL d’iRock.REMARQUE : Pour tester l’efficacité de l’isolement, transférer 105 cellules/tube dans un tube (échantillon d’essai post-trié) qui sera utilisé plus tard pour la cytométrie en flux (comme décrit aux étapes 4.3.9-4.3.13). Aspirez lentement la laminine des copeaux fluidiques en plaçant la pointe d’un P200 à l’intérieur du réservoir sur le bord du canal.REMARQUE : Si le liquide est difficile à collecter, soulevez lentement un côté de la puce pour aider le liquide à se déplacer vers le réservoir opposé. Ajoutez la suspension cellulaire régulièrement dans le canal pour vous assurer qu’aucune bulle ne se forme.REMARQUE : Effectuez les étapes 3.3.4 à 3.3.5 rapidement mais doucement pour éviter que la laminine ne se dessèche et ne forme des bulles dans les canaux de la puce. Si des bulles se forment, soulevez un côté de la puce et tapotez doucement la lame pour mobiliser les bulles ; Lorsqu’ils atteignent le réservoir, ils s’élèvent jusqu’à l’interface aérienne et ne devraient pas être en mesure de louer le canal. Transférez la puce dans l’incubateur et laissez-les toute la nuit pour que les cellules soient complètement attachées au canal et aient l’air allongées. Lorsque les cellules sont complètement attachées, aspirez le milieu comme à l’étape 3.3.4 et remplacez-le par 200 μL de SFM-34 supplémenté en cytokines. À partir de maintenant, remplacez le milieu quotidiennement jusqu’à ce que les cellules aient atteint 90%-100% de confluence. 4. Application d’un flux continu aux cellules endothéliales – Aorte sur puce Préparer les matériaux et les réactifs.Préparez le milieu Mix 4 SFM-34 en complétant 18 mL de milieu SFM-34 avec les cytokines Mix 4 selon le tableau 2 et placez-le dans un tube de 50 mL dans l’incubateur avec le couvercle légèrement dévissé pour faciliter les échanges gazeux. Placez les ensembles de perfusion sélectionnés et tout tuyau à utiliser pour la configuration fluidique dans l’incubateur pour dégazer. Assemblage d’un système fluidiqueInstallez le set de perfusion dans l’appareil conformément au protocole du fabricant.REMARQUE : N’oubliez pas d’utiliser des pinces dans le système. Si des pinces coulissantes sont utilisées pour cette étape, elles doivent être glissées sur le tube avant de se connecter à la puce. Fixez une nouvelle puce fluidique et ajoutez le milieu SFM-34 supplémenté en cytokines, en veillant à remplir les deux réservoirs dans des conditions stériles dans la hotte. Effectuez le programme d’élimination des bulles et l’étape d’étalonnage. Retirez l’unité fluidique avec l’ensemble connecté de l’incubateur et transférez-la dans la hotte ; Prenez également les puces contenant les cellules de l’incubateur. Fixez le tube des deux côtés de la puce de test. Retirez le tube de la puce de test.REMARQUE : Vérifiez qu’aucune bulle n’est présente dans le connecteur Luer à l’extrémité du tube. Si des bulles sont visibles, aspirez-les soigneusement à l’aide d’une pipette P200 et, si nécessaire, ajoutez plus de milieu pour vous assurer que le connecteur est rempli de milieu. Connectez la puce contenant les cellules avec le tube. Retirez ou ouvrez les pinces. Transférez le système dans l’incubateur et connectez la pompe à air à l’unité fluidique. Démarrez le programme présélectionné à l’aide du logiciel dédié à la pompe (figure supplémentaire S2) avec l’augmentation progressive de la contrainte de cisaillement décrite dans le tableau 3.REMARQUE : Selon l’expérience spécifique nécessaire, le programme de stimulation peut avoir besoin d’être optimisé. Il s’agit ici d’une augmentation progressive de la contrainte de cisaillement conduisant à la valeur finale de 5 dyn/cm2, qui imite la contrainte de cisaillement calculée pour être subie par la paroi de l’aorte dorsale au début de la circulation fœtale 9. Indépendamment de la contrainte de cisaillement finale qui sera utilisée, il est nécessaire d’augmenter progressivement au fil du temps pour permettre aux cellules de s’adapter à la force sans provoquer le détachement des cellules de la puce. Si le protocole de stimulation sélectionné dure plus de 3 jours, les cytokines doivent être complétées dans le système en ajoutant 1 mL de SFM-34 contenant les cytokines Mix 4 qui seraient normalement ajoutées dans 18 mL. Pour ce faire, le programme de pompe est rapidement mis en pause et 500 μL de milieu supplémenté sont ajoutés à chacune des deux seringues du kit fluidique. Prélèvement de cellules pour analysePréchauffer le tampon de dissociation au bain-marie. Retirez l’unité fluidique de l’incubateur et déplacez-la dans la hotte. Fixez le tube flanquant le copeau des deux côtés et retirez le tube des réservoirs du chip. Retirez délicatement le milieu de la puce et remplacez-le par du DPBS Ca2 + Mg2+ pour laver les cellules.REMARQUE : Cette étape de lavage avec PBS peut être sautée si les cellules commencent à se détacher. Ajouter délicatement 150 μL de tampon de dissociation et incuber pendant 3 min à 37 °C.REMARQUE : Vérifiez au microscope si les cellules sont simples et détachées ; sinon, incuber pendant 2 minutes supplémentaires. Il est essentiel que les cellules soient complètement détachées du canal avant d’aspirer le milieu, car la puce ne permet pas de faciliter le détachement des cellules par pipetage. D’autres solutions peuvent être utilisées pour détacher les cellules, telles que la trypsine ou les tampons à base d’EDTA. Récupérez le tampon de dissociation contenant les cellules d’un réservoir et transférez-le dans un tube à centrifuger de 15 ml et lavez le canal une fois avec du DPBS pour recueillir toutes les cellules détachées. Ajouter 1 mL de tampon de lavage dans le tube de 15 mL avec les cellules et prendre 10 μL pour compter les cellules. Divisez la suspension cellulaire dans des tubes de cytométrie en flux pour avoir 10 à5 cellules par tube à essai. Essorez les tubes pendant 5 min à 300 × g. Préparez la solution de coloration pour qu’elle contienne 50 μL pour chaque tube à essai à colorer. Ajouter le CD34 PerCP-efluor710 ou le CD34-PE à une dilution de 1 :100 et 1 :200, respectivement. Remettre les cellules en suspension dans 50 μL de solution colorante et incuber pendant 30 min à 4 °C. Lavez les cellules en ajoutant 2 mL de tampon de lavage et essorez pendant 5 min à 300 × g. Remettre les pastilles en suspension dans 100 μL de solution colorante et acquérir les données à l’aide d’un cytomètre en flux.REMARQUE : Les cellules peuvent également être lysées directement dans la puce pour l’extraction de l’ARN à l’aide de 150 μL de tampon de lyse de l’ARN ou fixées pour l’imagerie à l’aide de paraformaldéhyde à 4 % dans du DPBS pendant 10 min à température ambiante. Analyse de l’orientation des cellulesAnalysez les images pour quantifier les changements d’orientation des cellules à l’aide de FIJI23 (figure supplémentaire S3).Ouvrez le gestionnaire de régions d’intérêt (ROI) à partir de l’onglet Analyser | Outils | Menu du gestionnaire de retour sur investissement . Dessinez manuellement les contours des cellules à l’aide de l’outil de sélection de polygones et ajoutez-les au gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur Ajouter ou en utilisant le raccourci CTRL+T . Mesurez l’orientation de chaque retour sur investissement en choisissant la mesure d’ellipse Ajuster dans l’onglet Analyser | Définir le menu Mesures . Appliquez la mesure à tous les retours sur investissement grâce à la Plus… Commande multi-mesures dans le gestionnaire de ROI.REMARQUE : Cette étape permet d’ajuster une ellipse à chaque ROI et de générer un tableau contenant la longueur des axes de l’ellipse principale et mineure, ainsi que l’angle. Exportez le tableau dans un fichier CSV pour l’importer dans un autre logiciel afin de le tracer.NOTE : Le script utilisé pour les tracés est disponible à l’adresse https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf8850ddc.