방선균테리오파지 감염을 특성화하기 위한 적응형 광학 밀도 기반 마이크로플레이트 분석

이 프로토콜은 Gordonia terrae용으로 작성되었지만 Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta 및 Gordonia westfalica에도 성공적으로 사용되었습니다. 1. 박테리아 준비 생물 안전 캐비닛에서 Good Microbiological Practice 17을 사용하여 Gordonia terrae CAG3의 단일 콜로니를 0.01mg/mL 시클로헥시미드가 포함된 펩톤 효모 칼슘 브로스18(PYCa) 200mL와 함께1L 멸균 배플 플라스크에 접종합니다(재료 표 참조). 플라스크를 30°C에서 배양물이 포화될 때까지 또는 3일 동안 250 rpm으로 진탕하면서 인큐베이션한다7. 포화 G. terrae 배양액을 PYCa 배지에 연속적으로 희석하고, PYCa 플레이트 19,20에 10-4, 10-5 및 10-6 희석액을 각각 100 μL를 스프레드 플레이트로 희석한다. 희석되지 않은 포화 배양액을 4°C에서 냉장 보관한다. 확산 플레이트를 30°C에서 3일 동안 거꾸로 배양한다. 배양 후, 20-200 개의 콜로니가있는 플레이트 인 “셀 수있는 플레이트”를 확인하십시오. 그 판에 있는 집락의 수를 세고 밀리리터당 집락 형성 단위(cfu/mL)를 계산하십시오.19,20. PYCa 배양액으로 포화 배양액을 4.0 x 106 cfu/mL 박테리아로 희석합니다. 2. 파지 준비 참고: 보고된 대표적인 결과는 G. terrae에서 분리된 온대 박테리오파지인 Gordonia 파지 DelRio21로 얻은 것입니다. 이들 방법은 또한 다른 고르도니아 파지와 함께 성공적으로 사용되었다. 분리된 박테리오파지로 시작하여, 파지 완충액7에서 파지 샘플을 1 x 10-8 희석액으로 연속적으로 희석한다. 0.3 mL의 포화 G. terrae 배양물을 각 파지 희석액 10 μL로 감염시켜 이중층 한천 파지 역가 분석7을 수행하였다. 5-10 분 실온 배양 후, 박테리아 – 파지 혼합물을 3 mL의 PYCa 상단 한천과 결합하고, PYCa 한천 플레이트에 부어 넣는다. 30°C에서 3일 동안 또는 플라크가 형성될 때까지 거꾸로 된 플레이트를 인큐베이션한다 7. 배양 후, 20-200 개의 플라크가있는 플레이트 인 “셀 수있는 플레이트”를 확인하십시오. 해당 플레이트의 플라크 수를 세고 밀리리터당 플라크 형성 단위(pfu/mL)7를 계산합니다. 3. 마이크로플레이트 준비 알림: 이 방법에는 바닥이 평평한 96웰 마이크로플레이트( 재료 표 참조)를 사용해야 합니다. 모든 플레이트 준비 및 로딩은 생물 안전 캐비닛에서 완료되어야 하며 Good Microbiological Practice17을 사용해야 합니다. Triton-X 100 100 μL, 100% 이소프로판올 40mL, 탈이온수22 160mL를 혼합하여 김서림 방지 뚜껑 코팅 용액을 준비합니다. 섞이도록 저어주고 실온에서 보관하십시오. 생물 안전 캐비닛에서 멸균 된 6 웰 마이크로 플레이트 뚜껑의 내부 표면에 96 mL의 뚜껑 코팅 용액을 넣고 뚜껑의 가장자리를 잡고 회전시켜 용액으로 덮이도록합니다. 용액을 뚜껑에 20초 동안 그대로 둔 다음 용액을 붓고 뚜껑이 완전히 마를 때까지 오토클레이브 종이 타월로 뚜껑을 비스듬히 뒤집습니다(일반적으로 35-45분 소요). 뚜껑의 가장자리를 잡으십시오. 각 96-웰 마이크로플레이트에 대해 물 중 0.1% 아가로스 20 mL를 준비하고, 전자레인지에 돌려 아가로스를 녹인다. 일단 아가로오스가 50-60°C로 냉각되면, 100 μL의 0.1% 아가로스를 플레이트의 웰 사이의 모든 공간으로 피펫하고, 200 μL의 아가로스를 열 A 및 열 H 및 열 1, 열 2, 열 11, 및 열 12의 웰 내로23 번 피펫한다(도 1). 4. 플레이트에 박테리아와 파지 넣기 알림: 모든 플레이트 준비 및 로딩은 생물 안전 캐비닛에서 완료되어야 하며 우수한 미생물 실습17 을 사용해야 합니다. 96웰 플레이트에는 각 웰에 2.0 x 106cfu/mL 박테리아 75μL이 포함됩니다9. 4.0 x 10 6 cfu/mL 세균 배양액을 2x PYCa 배양액으로 1:1로 2.0 x 106 cfu/mL로 희석합니다. 96웰 플레이트당 5mL를 준비합니다. 파지 버퍼7 을 사용하여 파지 용해물을 희석하여 각각 2.0 x 106 pfu/mL, 2.0 x 105 pfu/mL 및 2.0 x 104 pfu/mL 농도의 1mL를 만듭니다. 이것은 마이크로플레이트9 내에서 1, 0.1 및 0.01의 감염 다중도(MOI)를 허용합니다. 마이크로플레이트를 로드하려면 김서림 방지 용액과 아가로스로 준비된 플레이트를 가져와서 그림 1에 따라 2.0 x 106cfu/mL 박테리아 75μL를 컬럼 3-10에 피펫합니다. 컬럼 3과 컬럼 4에 75μL의 멸균 파지 버퍼를 각 웰에 추가하여 그림 1에 따라 파지가 없는 양성 대조군으로 사용하고 각 첨가 후 피펫을 위아래로 혼합합니다. 컬럼 5 및 컬럼 6에 2.0 x 106 pfu/mL 파지 75 μL, 컬럼 7 및 컬럼 8에 2.0 x 105 pfu/mL 파지 75 μL, 컬럼 9 및 컬럼 10에 2.0 x 10 4 pfu/mL 파지 75 μL를 추가하고, 각 첨가 후 혼합하기 위해 위아래로 피펫팅합니다. 플레이트의 양쪽 짧은 면을 0.5인치 라벨링 테이프로 테이프로 감아 가스 교환을 허용하면서 플레이트를 부분적으로 밀봉합니다. 5. 배양 및 흡광도 측정 플레이트에 박테리아와 파지가 로드되면 250rpm의 마이크로플레이트 셰이커에 놓고 30°C에서 배양합니다. 플레이트를 96시간 동안 배양하고 16시간부터 8시간마다 마이크로플레이트 리더에서 600nm에서 광학 밀도를 측정합니다. 측정 사이에 플레이트를 셰이커로 되돌립니다.참고: 0시간부터 4시간, 6시간, 8시간 및 12시간의 측정 기간을 평가했으며, 감염 후 16시간에서 시작하는 8시간 샘플링 기간이 고르도니아-파지 상호작용을 가장 잘 포착한 것으로 확인되었습니다. 실험 내내 뚜껑에 응결이 있는지 모니터링합니다. 응결이 관찰되면 3.2단계에 따라 코팅된 다른 뚜껑으로 뚜껑을 교체하십시오. 프로토콜 섹션 6에 따라 대조군 및 감염된 성장 곡선을 생성합니다. 6. 데이터 분석 스프레드시트 프로그램을 사용하여 Stacy-Ceballos-Index GitHub 리포지토리(https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index)의 스프레드시트 레이아웃에 따라 각 파지 희석에 대한 평균 및 표준 편차를 계산합니다. DescTools24, dplyr25, ggplot2 26 및 readxl27 패키지와 함께 Stacy-Ceballos-Index GitHub 리포지토리(https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index)의 R 스크립트에 따라 R(재료 표 참조)을 사용하여 대조군 및 감염된 성장 곡선을 만들고 감염 지표를 계산합니다.AUCcon 은 감염되지 않은 대조군 곡선 아래 면적이고, AUCinf 는 감염 곡선 아래 면적이다16. AUC를 계산한 다음 다음 방정식을 사용하여 곡선 아래 면적 값인 PIAUC16을 기준으로 성장 억제율을 계산합니다.(1 – [AUCinf/AUCcon]) × 100 각 곡선의 수평선 점선은 N 점근선(con)으로 표시된 감염되지 않은 성장 피크와 N 점근선(inf)으로 표시된 감염되지 않은 성장 피크와 함께 최대 성장을 나타냅니다. N점근선 값을 식별한 다음, 다음 방정식을 사용하여 이러한 피크 성장 값, PIMAX16을 기반으로 성장 억제 백분율을 계산합니다.(1 – [N점근선(inf)/ N점근선(con)]) × 100 다음과 같이 PIAUC 및 PImax 값으로부터 Stacy-Ceballos 지수 ISC16을 계산한다.(PIAUC × PImax) 0.5시간 경과에 따른 Stacy-Ceballos 지수를 적분하여 상대적 독성을 계산합니다16.