所提出的宫颈操作方法可以在小鼠中诱导假妊娠,而无需用输精管切除的雄性繁殖雌性。诱导假妊娠是非手术胚胎移植和非手术人工授精成功所必需的,两者都被介绍。
为了通过胚胎移植或人工授精成功维持怀孕,必须诱导雌性受体小鼠进入假怀孕状态。传统上,雌性小鼠与输精管切开的雄性配对过夜,第二天早上,评估交配塞的存在。为了提高生产假性雌性妊娠的效率,宫颈操作技术已被标准化,与小鼠的非手术胚胎移植或人工授精技术结合使用。将小塑料棒的钝端阴道插入以接触子宫颈,并通过与修剪器接触振动 30 秒。该过程很快,不需要麻醉或镇痛。该技术提高了生产假性妊娠女性的可靠性和可预测性,并完全消除了对输精管切除男性的需求。对于CD1小鼠,发情期雌性使用宫颈操作诱导假妊娠的效率为83%(N = 76),但发情期雌性中只有38%被输精管切除的雄性堵塞(N = 24)。CD1小鼠的人工授精是通过发情与激素同步,宫颈操作和精子的子宫移植进行的。接受宫颈操作的人工授精接受者(N = 76)的怀孕率为72%,平均产仔数为8.3只幼崽。该方法也可用于生产假性妊娠女性进行非手术胚胎移植。因此,在进行非手术辅助生殖技术时,通过宫颈操作诱导假妊娠是与输精管切除的男配的方便有效的替代方案。使用宫颈操作通过减少所需的动物数量并消除手术改变雄性的必要性,为辅助生殖技术提供了3R(替换,减少和细化)的好处。
辅助生殖技术用于生产转基因小鼠模型,以及从冷冻保存中恢复菌株,从受损的健康状况中重新衍生菌株,以及战略性动物饲养管理,包括生产年龄匹配的队列。小鼠的所有辅助生殖技术都需要使用假怀孕雌性受体进行胚胎发育。从历史上看,假怀孕受者是通过与不育雄配产生的,这些雄性要么是手术输精管切除术,要么是遗传性不育的,第二天早上评估交配塞的存在1。最近,已经开发出一种用于小鼠声波刺激的方案,用于原核或双细胞小鼠胚胎的手术移植2。我们还开发了一种宫颈操作(CM)方案,用于人工授精和囊胚的非手术胚胎移植。使用该程序的基本原理是将所需动物数量减少3R(不再需要雄性小鼠)并改进所用技术(不再需要雄性小鼠的手术输精管切除术)。该协议的描述包括相关的辅助生殖技术,以帮助将CM集成到正常工作中。CM方法的总体目标是取代在假怀孕雌性生成中使用雄性小鼠进行辅助生殖技术,包括人工授精和胚胎移植。
这里描述的CM方案最初是为了协助小鼠的人工授精而开发的。如最初所述,人工授精方案实现了 50% 的怀孕率,平均产仔数为 7 只幼崽3。CD1受体小鼠在授精前47小时间隔内发情与低剂量激素同步,包括怀孕母马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)。发情同步的一个优点是它允许在正常工作时间内使用协议。雌性在人工授精后立即与输精管切除的雄性配对,并通过交配栓的存在确认交配。据报告,与受体的交配率不一致是手术中的一个困难。因此,寻求交配的替代方法来诱导假妊娠。
本研究提出了一种标准化的CM技术,以提高假怀孕女性的生产效率。对于发情期或发情期的女性,将小塑料棒的钝端阴道插入以接触子宫颈,并通过与修剪器接触振动 30 秒。该过程在钢丝顶笼上进行。不需要麻醉或镇痛。CM技术便于生产假性妊娠雌性,非手术人工授精后即可产仔,无需与输精管切除的雄配。CM也可用于生产假怀孕的女性作为胚胎移植的接受者。具体来说,CM技术可以与非手术胚胎移植配对,如此处所述。非手术方法已被证明对小鼠4,5和大鼠6,7的囊胚期胚胎移植有效。由于这种非手术方法是手术方法的有效替代方案,因此它被认为是该技术的3R改进。根据先前的研究,粪便皮质酮水平作为压力的衡量标准表明,该程序的非手术性质不会增加啮齿动物的压力水平7,8。与手术胚胎移植相比,这些程序在技术上的挑战性要小得多,并且执行速度要快得多。当胚胎被转移到子宫时,必须移植子宫发育正确阶段的胚胎。对于小鼠,囊胚被转移到后2.5天(dpc)假怀孕接受者。
对于这里描述的两种非手术技术,激素给药的时间和CM技术不同。CM手术相对于发情的时机对于成功很重要,因为它取代了假怀孕受者产生的自然交配。通过消除输精管切除雄性诱导假妊娠的需要,该程序通过减少所需的动物数量和消除手术改变雄性的必要性来提供3R益处。该过程本身很快(30秒),不需要麻醉或镇痛。该技术大大提高了生产假怀孕雌性用于辅助生殖的可靠性和可预测性。
3R是动物在研究中使用的伦理框架,正如Russel和Burch在1959年“人道实验技术原理”15中所描述的那样。3R代表动物使用的替代,减少和改进。此处突出显示的协议与3R一致。宫颈操作技术减少了所需的动物数量,不再需要使用雄性来产生假怀孕的雌性。该技术还消除了对男性进行输精管切除术的需要,从而通过减轻疼痛和痛苦来提供改进。这里描述的辅助生殖技术(人工授精和胚胎移植)是非手术的,因此,两者都通过减少由其手术替代方案引起的疼痛和痛苦8来提供3R细化。
在小鼠1中进行辅助生殖时,使用假怀孕雌性对于幼崽的恢复是必要的。CM程序是产生假性怀孕女性的有效方法,但受体女性发情周期阶段的同步是该过程的关键第一步。发情同步可以大大减少菌落中准备潜在受体所需的雌性数量,并有助于按需生产定时假妊娠雌性。使用低剂量的激素似乎不会对CD1小鼠活窝的恢复造成任何有害影响。必须注意其他菌株,以找到激素和浓度组合,为移植的胚胎或精子产生最优质的受体女性。使用PMSG和hCG16可以实现同步,但产生超排卵女性的剂量可能不适合持续妊娠17。
为了确定女性是否处于发情期,在这项工作中进行了细胞学评估。发情期也可以通过观察阴道开口11,18来评估。虽然这种方法非常有用,可以单独使用或作为确认使用,但它比使用细胞学更主观。无需染色的阴道细胞学检查对于选择发情期的女性既快速又有效,因为角化上皮细胞很容易识别。在该协议中,在CM之前进行细胞学评估以确定潜在的受体。在CM之前进行细胞学检查很重要,因为该过程往往会使从阴道区域脱落的细胞碎裂,从而使鉴定变得困难。假妊娠或妊娠的细胞学评估可在CM(dpcm)后3.5-11.5天进行,连续3天。发情周期性女性的概况应至少为 1 天,角化上皮细胞大量浸润。假性妊娠/妊娠女性应连续 3 天显示双发性(主要是细胞数量可能较低的白细胞)。
通过CM技术的发展,发现一些小鼠比其他小鼠更容易接受该程序。CD1雌性小鼠是极好的候选者,因为它们具有冷静的天性和出色的培育本能。这种菌株易于处理,并且在CM和非手术辅助生殖技术中表现良好。C57Bl/6小鼠往往更具攻击性,养育能力较差。虽然该方案使用CM有效地产生了假怀孕的C57Bl / 6女性,但她们不太可能始终如一地允许该程序。这似乎与CM期间的发情期有关,发情期或发情期的女性更容易接受。使用富集管让动物进入允许进入阴道进行手术,并帮助使雌性平静下来。该程序本身并不能完全约束雌性,因此动物可以随时拉开。如果发生这种情况,可以重新定位动物,然后可以继续该过程。如果女性走开,手术的时间就会停止,并在手术恢复时恢复。手术成功的关键是发情周期的阶段(发情后期和发情)以及杆与子宫颈的接触。微调器的振动提供标准化的 CM。为了确保与子宫颈接触,对杆施加温和的压力,并通过杆的小来回运动确保杆与子宫颈的位置。
CM的使用改进了NSAI方案,因为在精子移植之前可以选择处于发情周期正确阶段的雌性,并且该方案不再取决于与输精管切除的雄配。人工授精发情周期同步的定时使得卵母细胞成熟对应于第4天早上的精子转移。该方案成功的关键是调整排卵时间,以便发生受精。在预期的精子移植前15-17小时必须注意施用hCG,如 体外 受精使用的时间建议的那样1。精子样本的质量将直接影响人工授精的结果。被激活的新鲜精子将表现最佳。冷冻保存的优质精子可以在 体内产生受精胚胎。但是,应注意直接转移解冻的精子,因为转移到子宫角的残留冷冻保护剂可能会抑制植入(未发表的观察结果)。
将CM与胚胎移植结合使用在概念上是一种简单的适应。发情周期同步减少了产生受体池所需的雌性数量。在CM之前确定发情期会增加获得假性妊娠受者的可能性。该方法的一个缺点是胚胎移植时受体的细胞学处于流动阶段。如果女性从发情期过渡到假妊娠期,则存在所有细胞类型,并且只有在细胞学检查跟踪数天后假妊娠才会变得明显。基于CD1和C57Bl/6小鼠从发情期过渡到假妊娠的成功(>80%),该方法有望适用于胚胎移植受者。初步结果显示,有限的非手术胚胎移植取得了良好的成功。一般来说,非手术胚胎移植的效率与手术技术相当4,5,并且非手术移植可以在囊胚阶段代替手术胚胎移植。对于早期胚胎,需要胚胎培养到囊胚阶段。但是,如果首选手术转移,则可以使CM技术适应适当的假妊娠受者所需的正确时间2。一般来说,胚胎接受者比胚胎早1天。例如,囊胚以3.5 dpc从供体处收获,并转移到2.5 dpc接受者。因此,需要进行CM以使受体处于比胚胎更不发达的假性怀孕状态。
总之,这里概述的CM技术显示出与其他小鼠辅助生殖技术集成的良好前景。我们已经为使用非手术技术的人工授精和胚胎移植提供了成功的方案。综合起来,CM技术提供了3R的优势,包括(1)通过消除对输精管切除的雄性的需求来减少动物数量,以及(2)通过用非手术替代方案取代手术技术来改进技术。
The authors have nothing to disclose.
本出版物中报告的研究得到了美国国立卫生研究院研究基础设施计划办公室主任办公室的支持,奖励编号为R43OD020304,美国国立卫生研究院国家心理健康研究所的奖励编号为R44MH122117。内容完全由作者负责,并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。
Blastocyst stage embryos | |||
CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
Wire bar topped mouse cage |