基于脱细胞的骨骼肌脂肪浸润定量

小鼠的护理和处死是按照美国国立卫生研究院实验动物使用和护理指南进行的。所有工作都得到了圣路易斯医学院华盛顿大学动物研究委员会的批准。使用2-3个月的雄性C57BL / 6J小鼠（参见 材料表）生成该协议中包含的示例图像。下面描述的所有步骤都在室温下进行。 1.肌肉脱细胞 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备1%w / v十二烷基硫酸钠（SDS;参见 材料表）溶液。搅拌溶液直至完全混合。注：1%SDS可以散装制备，并在室温下储存1个月。 如前所述解剖感兴趣的肌肉38,39。用70%乙醇溶液润湿头发和皮肤，然后做一个约2厘米的经皮切口，然后用镊子和弹簧剪刀去除覆盖的皮肤，暴露感兴趣的肌肉。注意：这里感兴趣的肌肉包括胫骨前肌 （TA）、趾长伸肌 （EDL） 和膈肌。一些肌肉可能位于其他肌肉组织的深处，需要解剖其他肌肉（例如，解剖 EDL 需要切除 TA）。 使用锋利的剪刀或刀片解剖感兴趣的肌肉（参见 材料表），以确保获得肌肉的整个范围并且边缘光滑。注意：理想情况下，这是在解剖显微镜下完成的，以改善可视化。 检查肌肉以确保没有骨屑或粗糙的边缘，然后根据需要用锋利的剪刀修剪掉这些。 使用分析天平称量肌肉并记录重量。 将解剖的肌肉置于每毫克体重至少 0.1 mL 的 1% SDS 中;6、12 或 24 孔板分别适用于隔膜、TA 和 EDL 小鼠肌肉。6 孔板、12 孔板和 24 孔板的典型体积分别为 6 mL、3 mL 和 1.5 mL。注意：SDS 溶液有时会导致肌肉变形，因此请确保肌肉在初始浸泡时是平坦/伸展的。 将孔板（或其他容器）放在设置为 50-80 Hz 的摇摆器上。 定期目视检查SDS溶液。当溶液变得浑浊时，用移液管取出溶液（注意不要吸出肌肉），并用等体积的新鲜1%SDS代替。当溶液保持透明24小时时，脱细胞完成。注意：溶液变化所需的频率因肌肉大小和初始溶液体积而异。像 TA 这样的较大肌肉在几个小时内需要新的 SDS，而像 EDL 这样的较小肌肉可以在原始解决方案中过夜。 用移液管从脱细胞肌肉中取出最终的SDS溶液（注意不要吸出肌肉），并用等体积的PBS代替。 在解剖显微镜下目视检查脱细胞肌肉，并使用镊子和剪刀去除粘在肌肉上的任何毛发或碎屑。注意：另外，请注意此步骤中脱细胞肌肉的清晰度。如果脱细胞肌肉不完全透明，并且SDS溶液在24小时内没有增加浑浊度，则脱细胞无效。这在定性和定量评估中产生了伪影，因此在进行实验肌肉之前，应始终对练习样品进行脱细胞优化。 小心地除去PBS，用等体积的3.7%甲醛或4%多聚甲醛溶液代替，并将板放回摇床24小时。注意：确保甲醛溶液完全覆盖脱细胞肌肉，否则染色会不均匀。 2. 用油红O可视化IMAT 准备ORO溶液。将 0.5 g ORO 粉末（参见 材料表）溶解在 100 mL 异丙醇中以生成储备溶液。注意：向溶液中加入温和的热量以使其完全溶解。该库存可在室温下储存 1 个月。 将ORO储备溶液和去离子水以60：40的比例混合，以使用至少0.1mL / mg肌肉重量的体积获得所有肌肉所需的工作溶液。6 孔板、12 孔板和 24 孔板的典型体积分别为 6 mL、3 mL 和 1.5 mL。注意： 混合前检查储备溶液。如果储备溶液含有大量颗粒，请制作新鲜的储备。 盖上工作溶液 10 分钟，让颗粒沉降。 通过40μm网过滤工作溶液，然后用0.22μm注射器过滤器过滤。注意：0.22 μm 注射器过滤器会迅速堵塞，如果工作溶液不容易通过，则必须更换。 除去甲醛或多聚甲醛溶液，并用等体积PBS的三次溶液变化洗涤脱细胞肌肉。 用等体积的60%异丙醇溶液替换PBS，并在摇床上孵育5分钟。 用ORO工作溶液代替60%异丙醇溶液，并在振荡器上孵育10分钟。注意：确保ORO工作溶液完全覆盖脱细胞肌肉，否则染色将不均匀。 用等体积的1%SDS代替ORO工作溶液。定期目视检查SDS溶液。当溶液明显变成粉红色时，用移液管取出溶液（注意不要吸出肌肉）并用新鲜的1%SDS代替。 当溶液保持透明24小时时，用PBS替换1%SDS，并在4倍放大倍率的解剖/立体显微镜下检查染色的肌肉。清除粘在肌肉外侧的任何明显碎屑或颗粒。如果这是广泛的，可以在清洁纸上轻轻滚动脱细胞的肌肉以去除碎屑/颗粒。 如果染色令人满意（鲜红色球体漂浮在透明基质中），则使用连接到立体显微镜的相机根据需要获取染色图像（参见 材料表）。注意： 如果解剖显微镜没有连接摄像头，则可以使用手机摄像头通过目镜拍照。 3. 使用BODIPY可视化IMAT脂滴 注意：共聚焦成像对 EDL 或隔膜（~2 mm 厚度）等薄肌肉最有效。或者，可以使用类似厚度的肌肉条，如 TA。 在PBS中制备1：200荧光BODIPY 493/503溶液（参见 材料表），以获得至少0.1mL / mg肌肉重量的工作溶液体积。6 孔板、12 孔板和 24 孔板的典型体积分别为 6 mL、3 mL 和 1.5 mL。 除去甲醛，多聚甲醛或1%SDS，并用等体积PBS的三次溶液变化洗涤脱细胞肌肉。 用BODIPY工作溶液替换PBS，并在振荡器上孵育20分钟。 用等体积的PBS的三次溶液变化洗涤脱细胞肌肉。 将肌肉置于与可用共聚焦显微镜兼容的透明底部血管中。理想情况下，培养皿将有一个凹陷的底部，以便在肌肉上放置盖玻片而不会使其变形（参见 材料表）。 使用488激光器使用标准共聚焦显微镜（参见 材料表）获得图像堆栈。EDL 的典型堆栈尺寸为 0.5-1 mm，切片厚度为 10 μm，每个堆栈可生成 50-100 个图像。注：为了量化总脂质体积、IMAT 脂滴总数和聚类的最近邻指数，通过整个肌肉体积成像，注意为图像配准留出一些重叠。为了量化平均脂滴体积，一个堆栈可能就足够了。 如果需要，根据第 2 节用 ORO 染色肌肉，以获得 IMAT 分布的免费全肌肉图像。注意：由于BODIPY是荧光的，因此在获取ORO图像时，在光学显微镜下将不可见。 4. 通过脂质提取估算总脂质体积 图像采集后，将肌肉转移到 96 孔板的单个孔中的 200 μL 异丙醇中，或者如果肌肉太大而无法适应，则调整孔/体积。 通过敲击板，上下移液溶液和/或用移液器吸头机械粉碎肌肉来搅拌溶液，直到在显微镜下在脱细胞肌肉中看不到红色/荧光球体。注意：用敲击、移液和挤压的相同组合处理所有肌肉，以获得最佳可靠性。此外，请注意限制敲击、移液和压碎所花费的时间，因为异丙醇会迅速蒸发。 通过上下移液在每个孔中混合溶液，然后将 75 μL 转移到板的两个干净孔中。 盖上板并使用分光光度计或酶标仪读取重复的 75 μL 孔的吸光度。如果构建体用 ORO 染色，则在 500 nm 处读取溶液;如果用 BODIPY 493/503 染色，则读取 493 nm 的板。注意：如果构建体同时用 BODIPY 和 ORO 染色，建议在 500 nm 处读取板，因为 500 nm 读取在仅用 ORO 染色的构建体和 ORO 加 BODIPY 之间产生相似的结果。 如果需要，将吸光度读数除以记录的肌肉重量，以校正样品之间的大小差异。 5. 共聚焦图像中IMAT脂滴指标的量化 注意：本部分需要访问 ImageJ 版本 1.47（参见 材料表）或更高版本以及基本的 ImageJ 技能40。 在 ImageJ 中打开共聚焦堆栈。注意：不同的共聚焦显微镜可能会以不同的格式保存共聚焦图像。ImageJ 可能需要额外的插件或变体，例如 Fiji，才能打开堆栈41。使用的算法是 ImageJ 软件包的一部分。 在 ImageJ 中运行阈值算法以识别 BODIPY 正像素。这会将当前图像转换为二进制图像。通过选择 “图像”>“调整阈值”>打开阈值用户界面。在用户界面中，选择 “Intermodes ”作为阈值类型，并确保选择 “深色背景 ”。无需选择其他选项。然后单击 “应用”。 将打开一个对话框，将堆栈转换为二进制。确保它选择了以下选项：方法：Intermodes;背景：黑暗。计算每个图像和黑色背景（二进制掩码）的阈值。这将生成一个二进制堆栈，其中白色表示 BODIPY 正像素，黑色表示 BODIPY 负像素。注意： Intermodes 阈值算法可能不是所有用户的最佳选择。对 ImageJ 内置阈值选项的主观检查有助于选择分离 BODIPY 正负像素的最佳算法。 在 ImageJ 中运行 Watershed 算法以分离接触的脂滴。选择 “处理”>“二进制>分水岭”。将打开一个对话框，询问是否应处理堆栈中的所有图像。选择 “是”。这增加了细黑线，划分了较大的纯白色区域。 使用 ImageJ 中的“分析粒子”算法确定 ROI。选择 “分析”（Analyze>“分析粒子”（Analyze Particles）。将打开一个对话框，用于设置选择设置。注：选择大小范围对于实现脂滴 ROI 的最佳估计至关重要。下限消除了可能太小而无法成为 IMAT 衍生的脂滴的区域（背景伪影），而上限消除了可能太大而无法成为单个 IMAT 衍生脂滴的区域（接触未被分水岭算法分离的脂滴）。 要设置这些值，请打开原始图像并使用椭圆形工具勾勒出视图中最小和最大的脂滴。然后，通过键入“t”将这些形状添加到 ROI 管理器中。选择 “分析”，然后选择 “设置测量”。将打开一个对话框，用于选择设置。选中“仅 区域 ”，然后单击 “确定”。然后，从 ROI 管理器中选择 “度量 ”。使用此结果窗口中的两个面积测量值作为“分析粒子”中的大小范围。 确保选中 Add to Manager 。不需要其他选项。 通过选中 ROI 管理器中的 “全部显示” ，将 ROI 叠加在共聚焦堆栈上。使用滑块单独检查每个堆栈切片，并使用椭圆形工具（位于 ImageJ 工具栏中）手动添加缺失区域。 输出 ROI 测量值。选择 “分析”>“设置测量 ”，然后选择 “面积”、“质心”、“拟合椭圆 ”和 “堆叠位置”。单击 “确定”。然后，从 ROI 管理器中选择 “度量 ”。可以选择“结果”表中的数据并将其复制到 Matlab 或 Excel 中，以便进一步分析。 使用 Refine.m Matlab 代码37 或类似算法将每个堆栈中的 ROI 细化为单个 ROI。注意：此步骤是必需的，因为步骤 5.2-5.4 将相邻切片中的相同脂滴识别为不同的 ROI。但是，也可以仅手动识别 ROI，也可以在 ImageJ 中手动消除重复的 ROI，以避免对 Matlab 的需求。 使用Matlab或Excel获取ROI中的汇总统计信息。将脂滴总数估计为 ROI 总数。 假设形状的深度是椭圆长轴和短轴的平均值，则将脂滴体积估计为拟合到每个 2D ROI 的椭圆的体积。 估计总脂质体积，即单个估计脂滴体积的总和。