Purification de la chromatine du locus génique en copie unique chez Saccharomyces cerevisiae

L’organisation dynamique des génomes eucaryotes en chromatine compacte l’ADN pour qu’il s’adapte aux limites du noyau tout en assurant une dynamique suffisante pour l’expression des gènes et l’accessibilité pour les facteurs régulateurs. En partie, cette polyvalence est médiée par le nucléosome, l’unité de base de la chromatine, qui comprend une particule centrale avec 147 pb d’ADN enroulé ~ 1,7 fois autour de l’octamère de l’histone¹. Le nucléosome est une structure très dynamique en ce qui concerne sa composition, avec de nombreuses variantes d’histones et des modifications post-traductionnelles (PTM) sur les queues d’histones N- et C-terminales. De plus, la chromatine eucaryote interagit avec une multitude d’autres composants essentiels, tels que les facteurs de transcription, les mécanismes de traitement de l’ADN et de l’ARN, les protéines architecturales, les enzymes impliquées dans le remodelage et la modification de la chromatine et les molécules d’ARN associées à la chromatine. Ces mécanismes cruciaux impliqués dans la transcription, la réplication et la réparation nécessitent tous un accès à la chromatine, qui sert de substrat naturel à ces processus. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à ces transactions d’ADN nécessite une définition précise des altérations collectives de la structure de la chromatine dans les régions génomiques spécifiques où ces mécanismes convergent et facilitent les réactions biologiques.

Malgré l’identification de nombreux facteurs de la chromatine par le biais d’études génétiques et d’études d’interaction protéine-protéine, la réalisation d’analyses directes, impartiales et complètes des interactions de la chromatine sur des sites génomiques particuliers est restée un obstacle important ^2,3. Dans un premier temps, seules des régions très abondantes du génome (c’est-à-dire des loci répétitifs) ou des plasmides multi-copies ont pu être isolés en quantités et en pureté suffisantes pour permettre l’identification par spectrométrie de masse des protéines associées 4,5,6,7. Une série de nouvelles approches basées sur l’hybridation directe de sondes de capture à l’ADN chromatinisé, la biotinylation de proximité à l’aide du système CRISPR-dCas9 ou la liaison de protéines adaptatrices spécifiques à la séquence au locus d’intérêt ont commencé à démêler le protéome des loci à copie unique à partir de génomes de levures et de mammifères ^8,9,10. Cependant, toutes ces méthodes nécessitent la réticulation du formaldéhyde pour stabiliser les interactions protéine-ADN et la sonication pour solubiliser la chromatine en vue d’une purification ultérieure. Ensemble, les deux manipulations excluent la possibilité d’études structurelles et fonctionnelles ultérieures de la chromatine purifiée.

Pour surmonter ces limitations, nous avons précédemment conçu une méthodologie qui utilise la recombinaison spécifique au site pour extraire les domaines chromosomiques ciblés de la levure^11,12. Essentiellement, la région génomique d’intérêt est entourée de sites de reconnaissance (RS) pour la R-recombinase spécifique du site de Zygosaccharomyces rouxi tout en incorporant simultanément un groupe de trois sites de liaison à l’ADN pour la protéine répressive transcriptionnelle procaryote LexA (LexA) dans la même région. Les cellules de levure contiennent une cassette d’expression pour l’expression simultanée de la R-recombinase et une protéine LexA fusionnée à un marqueur de purification par affinité en tandem (TAP). Après l’induction de la R-recombinase, l’enzyme excise efficacement la région ciblée du chromosome sous la forme d’un domaine de chromatine circulaire. Ce domaine peut être purifié via la protéine adaptatrice LexA-TAP, qui se lie aux sites de liaison à l’ADN LexA, ainsi qu’à un support d’affinité. Cette méthode a été récemment utilisée pour isoler des domaines distincts de la chromatine contenant des origines de réplication sélectionnées du chromosome III¹³ de la levure.

L’un des avantages majeurs de cette approche ex vivo est qu’elle permet des analyses fonctionnelles du matériau isolé. Par exemple, les domaines d’origine de réplication purifiés avec cette méthode peuvent être soumis à des tests de réplication in vitro pour évaluer l’efficacité de la cuisson d’origine dans un tube à essai à partir de matrices de chromatine assemblées in vivo natives. À terme, la caractérisation biochimique et fonctionnelle du matériel isolé pourrait permettre la reconstitution des processus nucléaires à l’aide de protéines purifiées et de la matrice de chromatine native. En résumé, cette méthodologie ouvre une voie passionnante dans la recherche sur la chromatine, car il sera possible de suivre les changements collectifs de composition et de structure de la chromatine d’une région génomique spécifique subissant une certaine transaction chromosomique.