Einzelkopien-Genlocus-Chromatin-Aufreinigung in Saccharomyces cerevisiae

Die dynamische Organisation eukaryotischer Genome in Chromatin verdichtet die DNA, um in die Grenzen des Zellkerns zu passen, während gleichzeitig eine ausreichende Dynamik für die Genexpression und die Zugänglichkeit für regulatorische Faktoren gewährleistet wird. Diese Vielseitigkeit wird zum Teil durch das Nukleosom vermittelt, die Grundeinheit des Chromatins, das aus einem Kernpartikel mit 147 bp DNA besteht, das ~1,7-mal um das Histon-Oktamer¹ gewickelt ist. Das Nukleosom ist eine hochdynamische Struktur in Bezug auf seine Zusammensetzung, mit zahlreichen Histonvarianten und posttranslationalen Modifikationen (PTMs) an den N- und C-terminalen Histonschwänzen. Darüber hinaus interagiert das eukaryotische Chromatin mit einer Vielzahl anderer essentieller Komponenten, wie z. B. Transkriptionsfaktoren, DNA- und RNA-Verarbeitungsmaschinen, Architekturproteinen, Enzymen, die am Umbau und der Modifikation von Chromatin beteiligt sind, und RNA-Molekülen, die mit Chromatin assoziiert sind. Diese wichtigen Mechanismen, die an der Transkription, Replikation und Reparatur beteiligt sind, benötigen alle Zugang zu Chromatin, das als natürliches Substrat für diese Prozesse dient. Um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die diesen DNA-Transaktionen zugrunde liegen, ist daher eine genaue Definition der kollektiven Veränderungen in der Chromatinstruktur in den spezifischen Genomregionen erforderlich, in denen diese Maschinerien konvergieren und biologische Reaktionen erleichtern.

Trotz der Identifizierung zahlreicher Chromatinfaktoren durch genetische und Protein-Protein-Interaktionsstudien ist die Durchführung direkter, unvoreingenommener und umfassender Analysen von Chromatininteraktionen an bestimmten genomischen Stellen nach wie vor ein erhebliches Hindernis ^2,3. Ursprünglich konnten nur sehr häufig vorkommende Regionen des Genoms (d.h. repetitive Loci) oder Multikopienplasmide in ausreichender Menge und Reinheit für die massenspektrometrische Identifizierung der assoziierten Proteine isoliert^werden 4,5,6,7. Eine Reihe neuer Ansätze, die auf der direkten Hybridisierung von Fängersonden mit chromatinisierter DNA, der Proximity-Biotinylierung mit dem CRISPR-dCas9-System oder der Bindung sequenzspezifischer Adapterproteine an den interessierenden Locus basieren, haben begonnen, das Proteom von Einzelkopien-Loci aus Hefe- und Säugetiergenomen zu entschlüsseln ^8,9,10. Alle diese Methoden erfordern jedoch eine Formaldehydvernetzung, um die Protein-DNA-Wechselwirkungen zu stabilisieren, und eine Beschallung, um das Chromatin für die anschließende Reinigung zu lösen. Beide Manipulationen zusammen schließen die Möglichkeit nachfolgender struktureller und funktioneller Studien des gereinigten Chromatins aus.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir zuvor eine Methode entwickelt, die ortsspezifische Rekombination verwendet, um gezielte chromosomale Domänen aus Hefe zu extrahieren^11,12. Im Wesentlichen ist die interessierende genomische Region von Erkennungsstellen (RS) für die ortsspezifische R-Rekombinase aus Zygosaccharomyces rouxi umgeben, während gleichzeitig eine Gruppe von drei DNA-Bindungsstellen für den prokaryotischen Transkriptionsrepressor LexA-Protein (LexA) innerhalb derselben Region eingebaut wird. Die Hefezellen enthalten eine Expressionskassette für die gleichzeitige Expression von R-Rekombinase und einem LexA-Protein, das mit einem Tandem-Affinitätsreinigungstag (TAP) fusioniert ist. Nach der Induktion der R-Rekombinase schneidet das Enzym die Zielregion in Form einer zirkulären Chromatindomäne effizient aus dem Chromosom heraus. Diese Domäne kann über das LexA-TAP-Adapterprotein, das an die LexA-DNA-Bindungsstellen bindet, sowie an einen Affinitätsträger gereinigt werden. Diese Methode wurde kürzlich verwendet, um verschiedene Chromatindomänen zu isolieren, die ausgewählte Replikationsursprünge des Hefechromosoms III¹³ enthalten.

Ein großer Vorteil dieses Ex-vivo-Ansatzes besteht darin, dass er funktionelle Analysen des isolierten Materials ermöglicht. Zum Beispiel können Replikationsursprungsdomänen, die mit dieser Methode gereinigt wurden, In-vitro-Replikationsassays unterzogen werden, um die Effizienz des Ursprungsfeuers in einem Reagenzglas aus nativen in vivo assemblierten Chromatin-Matrizen zu bewerten. Letztendlich könnte die biochemische und funktionelle Charakterisierung des isolierten Materials die Rekonstitution von Kernprozessen unter Verwendung von gereinigten Proteinen zusammen mit dem nativen Chromatin-Template ermöglichen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methodik einen spannenden Weg in der Chromatinforschung eröffnet, da es möglich sein wird, die kollektiven Veränderungen der Zusammensetzung und der Struktur des Chromatins einer bestimmten Genomregion zu verfolgen, die eine bestimmte chromosomale Transaktion durchläuft.