Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Mitochondrien erfüllen in Eukaryoten eine Vielzahl unterschiedlicher Funktionen, wobei die bekannteste die Produktion von ATP durch oxidative Phosphorylierung ist. Weitere Funktionen sind die Produktion von Eisen-Schwefel-Clustern, die Lipidsynthese und in höheren Eukaryoten die Ca2⁺-Signalgebung und die Induktion der Apoptose 1,2,3,4. Diese Funktionen sind untrennbar mit ihrer komplexen Ultrastruktur verbunden.

Die mitochondriale Ultrastruktur wurde erstmals mittels Elektronenmikroskopie⁵ beschrieben. Es konnte gezeigt werden, dass Mitochondrien ziemlich komplexe Organellen sind, die aus zwei Membranen bestehen: der mitochondrialen Außenmembran und der mitochondrialen Innenmembran. Somit werden von diesen Membranen zwei wässrige Kompartimente gebildet: der Intermembranraum und die Matrix. Die mitochondriale Innenmembran kann noch weiter in verschiedene Abschnitte unterteilt werden. Die innere Grenzmembran bleibt in unmittelbarer Nähe zur äußeren Membran, und die Cristae bilden Einstülpungen. Sogenannte Crista Junctions verbinden die innere Grenzmembran mit den Cristae (Abbildung 1). Darüber hinaus zeigen elektronenmikroskopische Aufnahmen osmotisch geschrumpfter Mitochondrien, dass es Stellen gibt, an denen die Mitochondrienmembranen fest miteinander verbunden sind ^6,7. Diese sogenannten Kontaktstellen werden von Proteinkomplexen gebildet, die die beiden Membranen überspannen (Abbildung 1). Es wird angenommen, dass diese Interaktionsstellen aufgrund ihrer Bedeutung für die Regulierung der mitochondrialen Dynamik und Vererbung sowie für den Transfer von Metaboliten und Signalen zwischen dem Zytosol und der Matrix für die Lebensfähigkeit von Zellen unerlässlich sind⁸.

Der MICOS-Komplex in der mitochondrialen Innenmembran ist wahrscheinlich der am besten charakterisierte und vielseitigste kontaktstellenbildende Komplex. MICOS wurde 2011 in Hefe beschrieben und besteht aus sechs Untereinheiten 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19^, Mic12 und ^Mic10. Diese bilden einen Komplex von ca. 1,5 MDa, der an den Crista-Kontakten 9,10,11 lokalisiert ist. Die Deletion einer der beiden Kernuntereinheiten, Mic10 oder Mic60, führt zum Fehlen dieses Komplexes ^9,11, was bedeutet, dass diese beiden Untereinheiten für die Stabilität von MICOS essentiell sind. Interessanterweise bildet MICOS nicht nur eine, sondern mehrere Kontaktstellen mit verschiedenen mitochondrialen äußeren Membranproteinen und -komplexen: dem TOM-Komplex 11,12, dem TOB/SAM-Komplex 9,12,13,14,15,16, dem Fzo1-Ugo1-Komplex⁹,^Por1 10^, OM45 10 und Miro ¹⁷. Dies deutet stark darauf hin, dass der MICOS-Komplex an verschiedenen mitochondrialen Prozessen beteiligt ist, wie z. B. dem Proteinimport, dem Phospholipidstoffwechsel und der Bildung der mitochondrialen Ultrastruktur¹⁸. Die letztgenannte Funktion ist wahrscheinlich die Hauptfunktion von MICOS, da das Fehlen des MICOS-Komplexes, der durch die Deletion von MIC10 oder MIC60 induziert wird, zu einer abnormen mitochondrialen Ultrastruktur führt, der es praktisch vollständig an regelmäßigen Cristae mangelt. Stattdessen akkumulieren interne Membranvesikel ohne Verbindung zur inneren Grenzmembran^{19, 20}. Wichtig ist, dass MICOS in Form und Funktion von der Hefe bis zum Menschen konserviert ist²¹. Die Assoziation von Mutationen in MICOS-Untereinheiten mit schweren menschlichen Erkrankungen unterstreicht auch seine Bedeutung für höhere Eukaryoten^22,23. Obwohl MICOS sehr vielseitig ist, müssen zusätzliche Kontaktstellen vorhanden sein (basierend auf unseren unveröffentlichten Beobachtungen). In der Tat wurden mehrere andere Kontaktstellen identifiziert, zum Beispiel die mitochondrialen Fusionsmaschinen Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 oder Mdm31-Por1^, das an der Biosynthese des mitochondrial-spezifischen Phospholipids Cardiolipin beteiligt ist ²⁷. Kürzlich haben wir die Methode, die uns zur Identifizierung von MICOS führte, verbessert, um Cqd1 als Teil einer neuartigen Kontaktstelle zu identifizieren, die mit dem äußeren Membrankomplex Por1-Om14²⁸ gebildet wurde. Interessanterweise scheint diese Kontaktstelle auch an mehreren Prozessen wie der Homöostase der mitochondrialen Membran, dem Phospholipidstoffwechsel und der Verteilung von Coenzym Q^28,29 beteiligt zu sein.

Hier haben wir eine Variation der zuvor beschriebenen Fraktionierung der Mitochondrien 9,30,31,32,33 verwendet. Die osmotische Behandlung von Mitochondrien führt zur Störung der mitochondrialen Außenmembran und zu einer Schrumpfung des Matrixraums, so dass die beiden Membranen nur noch an Kontaktstellen in unmittelbarer Nähe sind. Dies ermöglicht die Erzeugung von Vesikel, die ausschließlich aus der mitochondrialen Außenmembran oder der mitochondrialen Innenmembran bestehen oder an Kontaktstellen beider Membranen durch milde Beschallung enthalten. Da die mitochondriale Innenmembran ein viel höheres Protein-zu-Lipid-Verhältnis aufweist, weisen mitochondriale Innenmembranvesikel im Vergleich zu mitochondrialen Außenmembranvesikeln eine höhere Dichte auf. Der Dichteunterschied kann genutzt werden, um die Membranvesikel durch Saccharose-Auftriebsdichtegradientenzentrifugation zu trennen. So akkumulieren die mitochondrialen äußeren Membranvesikel bei niedrigen Saccharosekonzentrationen, während die mitochondrialen inneren Membranvesikel bei hohen Saccharosekonzentrationen angereichert sind. Die Vesikel, die Kontaktstellen enthalten, konzentrieren sich bei mittleren Saccharosekonzentrationen (Abbildung 2). Das folgende Protokoll beschreibt diese verbesserte Methode, die im Vergleich zu unserer zuvor etablierten Methode³² weniger spezialisierte Ausrüstung, Zeit und Energie erfordert, im Detail und bietet ein nützliches Werkzeug zur Identifizierung möglicher Proteine an der Kontaktstelle.