척수 자극 중 운동 뉴런의 전체 세포 패치-클램프 기록을 위한 척수 절편의 생체 외 제조
Summary
이 프로토콜은 패치 클램프를 사용하여 높은 시공간 분해능으로 척수 자극(SCS)에 대한 운동 뉴런의 전기적 반응을 연구하는 방법을 설명하며, 이를 통해 연구자들은 척수를 분리하고 세포 생존력을 동시에 유지하는 기술을 향상시킬 수 있습니다.
Abstract
척수 자극술(SCS)은 척수 손상(SCI) 후 운동 기능을 효과적으로 회복할 수 있습니다. 운동 뉴런은 감각 운동 행동을 실행하는 최종 단위이기 때문에 SCS로 운동 뉴런의 전기 반응을 직접 연구하면 척추 운동 조절의 기본 논리를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다양한 자극 특성과 세포 반응을 동시에 기록하기 위해 패치 클램프는 단일 세포 규모에서 전기생리학적 특성을 연구하는 좋은 방법입니다. 그러나 이 목표를 달성하는 데에는 세포 생존력 유지, 뼈 구조에서 척수를 빠르게 분리, SCS를 사용하여 활동 전위를 성공적으로 유도하는 등 몇 가지 복잡한 어려움이 여전히 있습니다. 여기에서는 패치 클램프를 사용하여 높은 시공간 해상도로 SCS에 대한 운동 뉴런의 전기적 반응을 연구하는 상세한 프로토콜을 제시하며, 이를 통해 연구자가 척수 분리 및 세포 생존력 유지 기술을 향상시켜 운동 뉴런에 대한 SCS의 전기적 메커니즘을 원활하게 연구하고 불필요한 시행착오를 피할 수 있습니다.
Introduction
척수 자극술(SCS)은 척수 손상(SCI) 후 운동 기능을 효과적으로 회복할 수 있습니다. 안드레아스 로왈드(Andreas Rowald) 등은 SCS가 단 하루 만에 하지 운동과 몸통 기능을 가능하게 한다고 보고했다1. 운동 회복을 위한 SCS의 생물학적 메커니즘을 탐구하는 것은 보다 정확한 SCS 전략을 개발하기 위한 중요하고 추세적인 연구 분야입니다. 예를 들어, 그레구아르 쿠르틴(Grégoire Courtine)의 연구팀은 척수의 흥분성 Vsx2 인터뉴런과 Hoxa10 뉴런이 SCS에 반응하는 핵심 뉴런이며, SCI2 이후 쥐의 보행 능력을 회복하기 위해 세포 특이적 신경조절이 가능하다는 것을 입증했습니다. 그러나 단일 셀 규모에서 SCS의 전기적 메커니즘에 초점을 맞춘 연구는 거의 없습니다. 고전적인 오징어 실험 3,4,5에서 초임계 직류 자극이 활동 전위(AP)를 유도할 수 있다는 것은 잘 알려져 있지만, SCS와 같은 펄스 교류 전기 자극이 모터 신호 생성에 어떤 영향을 미치는지는 여전히 불분명합니다.
척추 내 신경 회로의 복잡성을 감안할 때, 세포 집단에 대한 적절한 선택은 SCS의 전기적 메커니즘을 조사하는 데 중요합니다. SCS는 고유수용성 경로(proprioceptive pathway)6를 활성화시킴으로써 운동기능을 회복시키지만, 운동뉴런(motor neuron)은 고유수용감각 정보 구심성 입력(affrioception information afferent input)7의 통합으로부터 유도된 운동 명령을 실행하는 최종 단위이다. 따라서 SCS를 사용하여 운동 뉴런의 전기적 특성을 직접 연구하면 척추 운동 조절의 기본 논리를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
아시다시피, 패치 클램프는 매우 높은 시공간 분해능(spatiotemporal resolution)8을 가진 세포 전기생리학적 기록을 위한 황금 표준 방법입니다. 따라서 본 연구에서는 SCS에 대한 운동 뉴런의 전기적 반응을 연구하기 위해 패치 클램프를 사용하는 방법을 설명합니다. 뇌 패치-클램프(9)와 비교했을 때, 척수 패치-클램프는 다음과 같은 이유로 더 어렵다: (1) 척수는 아주 작은 부피의 척추관에 의해 보호되며, 이는 더 나은 세포 생존력을 얻기 위해 매우 미세한 미세 조작과 엄격한 얼음처럼 차가운 유지가 필요하다. (2) 척수가 너무 가늘어서 절단 트레이에 고정할 수 없기 때문에 저융점 아가로스에 담그고 응고 후 다듬어야 합니다.
따라서 이 방법은 척수를 해부하고 동시에 세포 생존력을 유지하는 데 있어 운동 뉴런에 대한 SCS의 전기적 메커니즘을 원활하게 연구하고 불필요한 시행착오를 피할 수 있는 기술적 세부 사항을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
SCS에 의해 조절된 운동 정보는 최종적으로 운동 뉴런으로 수렴됩니다. 따라서 운동 뉴런을 연구 목표로 삼으면 연구 설계를 단순화하고 SCS의 신경 조절 메커니즘을 보다 직접적으로 밝힐 수 있습니다. 다양한 자극 특성과 세포 반응을 동시에 기록하기 위해 패치 클램프는 단일 세포 규모에서 전기생리학적 특성을 연구하는 좋은 방법입니다. 그러나 세포 생존력을 유지하는 방법, 뼈 구조에서 척?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 젊은 학자(52207254 및 82301657)와 중국 박사후 과학 기금(2022M711833)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
References
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