イン・ビトロBis-3-クロロピペリジンによるG-四重鎖DNA構造のケミカルマッピング
Summary
Bis-3-クロロピペリジン(B-CeP)は、 in vitroでDNAテンプレート中のG-四重鎖構造を同定および特性評価するための有用な化学プローブです。このプロトコルはB-CePsの調査の反作用を行い、高リゾリューションのポリアクリルアミドのゲルの電気泳動によって反作用生成物を解決するプロシージャを詳述する。
Abstract
G-四重鎖(G4)は、遺伝子発現や疾患において重要な役割を果たす生物学的に関連性のある非標準的なDNA構造であり、重要な治療標的となります。潜在的なG四重鎖形成配列(PQS)内のDNAの in vitro 特性評価には、アクセス可能な方法が必要です。B-CePは、核酸の高次構造を調べるための有用な化学プローブであることが証明されているアルキル化剤の一種です。この論文では、B-CePとグアニンの N7との特異的な反応性を利用した新しいケミカルマッピングアッセイと、それに続くアルキル化Gsでの直接鎖切断について説明します。
すなわち、G4フォールドとアンフォールドDNAの形態を区別するために、B-CeP 1を用いて、G4配列を仮定できる15-merのDNAであるトロンビン結合アプタマー(TBA)をプローブします。B-CeP応答グアニンとB-CeP1の反応により、高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により、アルキル化グアニンの個々のアルキル化付加物およびDNA鎖切断の位置を特定することにより、一塩基レベルで分離できる生成物が得られます。B-CePを用いたマッピングは、G-四重鎖形成DNA配列の in vitro 特性評価のためのシンプルで強力なツールであり、G-テトラッドの形成に関与するグアニンの正確な位置を特定することができます。
Introduction
核酸は、典型的なワトソン・クリック二重らせんに加えて、グアニンに富む配列により、代替のG-四重鎖(G4)型など、さまざまな二次構造を採用することができます。G4構造は、4つのグアニンがフーグステン水素結合を介して相互作用するG-テトラッドと呼ばれる平面四量体の形成に基づいています。G-テトラッドは、グアニンコアの中心に配位した一価の陽イオンによって積み重ねられ、さらに安定化されます(図1)1。
図1:G-四重構造の模式図 。 (A)G-テトラッドの模式図。平面アレイは、フーグスティーン塩基対形成と中心陽イオン(M+)によって安定化されます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
少なくとも2つの連続したグアニンヌクレオチドが4回以上ランされた配列は、G-四重鎖構造で折りたたまれる可能性のあるG-四重鎖形成配列(PQS)です。PQSは、テロメア、遺伝子プロモーター、リボソームDNA、組換え部位など、さまざまな細胞環境にあり、多くの生物学的プロセスの制御に関与しています2。したがって、ヒトゲノム中のG4の同定と実験的検証は、現在、主に計算ツールによって行われており、生物学的に重要な問題です3。計算による予測をサポートしたり、予測不可能なG4構造を検出したりするために、DNAテンプレート中のG4形成を同定するためのケミカルマッピングに基づくアクセス可能な方法がここに示されており、G-tetrad構造を形成するグアニンの正確な同定が可能です。
報告されたケミカルマッピングアッセイは、G4構造の形成に続くビス-3-クロロピペリジン(B-CeP)とグアニンとの異なる反応性を利用しています。B-CePは求核剤4,5,6,7,8,9との反応性が高いため、グアニンヌクレオチドのN7位と非常に効率的に反応する能力を持つ核酸アルキル化剤である10。アルキル化に続いて、一本鎖および二本鎖DNAコンストラクトの脱品と鎖切断が行われます。それどころか、G4配列におけるG-テトラッドの形成に関与するグアニンは、グアニンのN7位がフーグスティーン水素結合に関与しているため、B-CePアルキル化の影響を受けません。このB-CePの特異的な反応性により、G4構造の検出だけでなく、一本鎖および二本鎖DNA中のグアニンと比較してアルキル化からの相対的な保護から推定できるため、テトラドを形成するグアニンの同定も可能になります。
ここでは、カリウム陽イオンの存在下でG4配列を仮定できる15-mer DNAであるトロンビン結合アプタマー(TBA)の特性評価のプローブとして、B-CeP 1(図2A)を用いてケミカルマッピングプロトコルを報告しています11,12。TBA(G4-TBA)のG4配列は、2つのコントロール、すなわち一本鎖型のTBA(ssTBA)と、その相補的な配列にアニーリングされて二本鎖コンストラクト(dsTBA)を形成するTBAと直接比較されます(表1)。プロービング反応の生成物は、高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって、アルキル化グアニンの個々のアルキル化付加物とDNA鎖切断の位置を特定することにより、一塩基レベルで分離されます。ゲル上での可視化は、TBAオリゴヌクレオチドと3’末端に蛍光色素を結合させることで可能になります(表1)。このプロトコルは異なった構造(G4および対照)のTBAを折る方法、およびB-CePsとそれに続くPAGEの探る反作用を行う方法を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
G-四重鎖は、通常、グアニンに富むDNA配列内で折りたたまれる核酸二次構造であり、遺伝的制御や疾患との関連から重要な研究対象となっています。B-CePによるケミカルマッピングは、DNA G4の特性評価に有用なプロトコルであり、生理学的塩条件下でのG-テトラッドの形成に関与するグアニン塩基を同定するために使用できます。
このプロトコルで使用される化学プロー?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、パドヴァ大学薬理科学部(PRIDJ-BIRD2019)の支援を受けました。
Materials
| Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| Ammonium per-sulfate (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | pbi international | ||
| Boric acid | Sigma Aldrich | B0252 | |
| Bromophenol blue Brilliant blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Fluka | 71649 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | synthesis of custom sequences | |
| EDTA disodium | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Formamide | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| Gel imager | GE Healtcare | STORM B40 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Micro tubes 0.5 mL | Sarstedt | 72.704 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Sequencing apparatus | Biometra | Model S2 | |
| Silanization solution I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| Sodium phosphate monobasic | Carlo Erba | 480086 | |
| Speedvac concentrator | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
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