피부 생검에서 환자 유래 Podocytes의 생성

이 프로토콜은 Friedrich-Alexander University Erlangen-Nuremberg(251_18B)의 윤리 위원회의 승인을 받았으며 모든 환자와 프로밴드는 서면 동의를 했습니다. 모든 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다. 여기에 사용된 모든 매체 및 솔루션의 구성은 표 1을 참조하십시오. 1. 피부 펀치 생검에서 진피 섬유아세포의 성장 피부 펀치 생검을 10mL의 예열된 섬유아세포 배지가 있는 멸균된 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 배지를 제거하고 5mL의 멸균되고 예열된 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 피부 펀치 생검을 세 번 세척합니다. 멸균 겸자를 사용한 피부 펀치 생검을 10cm 세포 배양 플레이트에 옮기고 멸균 메스로 3-4 개로 너비로 자르고 표피와 진피를 남깁니다. 각 조각을 멸균된 35mm 플라스틱 세포 배양 접시에 옮기고 배양 접시에 부드럽게 누릅니다. 생검 조각 주변의 과도한 배지를 제거합니다. 액체가 증발하고 생검이 세포 배양 플라스틱에 부착될 때까지 5-10분 동안 건조시킵니다. 생검 주위에 1,000μL 피펫과 함께 섬유아세포 배지 1mL를 한 방울 떨어뜨리고 최종 부피 3mL까지 조심스럽게 채웁니다. 37°C, 5%CO2 에서 7일 동안 접시를 먹이거나 이동시키지 않고 배양한다. 배지를 신선하고 예열된 섬유아세포 배지로 조심스럽게 변경합니다. 7일 후, 성장된 방추형 섬유아세포를 위상차 현미경36을 사용하여 피부 생검 주위에서 모니터링할 수 있다.참고: 자란 섬유아세포가 접시 가장자리에 도달하면 1.3단계부터 다시 진행하여 또 다른 배치의 섬유아세포를 생성합니다. 성장한 섬유아세포의 확장을 위해, 예열된 1x PBS 2mL로 세척하고, 섬유아세포를 1mL의 1x 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 해리시키고, 37°C, 5%CO2에서 5분 동안 인큐베이션한다. 분리된 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 세포 배양 접시를 2mL의 신선하고 예열된 섬유아세포 배지로 세척합니다. 세척 매체를 튜브에 풀링하여 해리제를 중화하고 20°C에서 5분 동안 200 x g에서 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 1mL의 신선하고 예열된 섬유아세포 배지로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 신선한 세포 배양 플라스크에서 트리판 블루 및 시드 2.5 x 103 내지 5 x 10cm2 당3개의 섬유아세포를 사용하여 노이바우어 챔버 또는 자동 세포 계수기로 세포를 계수한다. 플라스크를 다시 인큐베이터에 넣고 플라스크를 각 방향으로 세 번 움직여 세포를 고르게 분배합니다. 다음날, 배지를 신선하고 예열된 섬유아세포 배지로 교체합니다. 일주일에 두 번 배지를 교체하고 섬유아세포가 약 80% 밀도에 도달하면 분할합니다. 2. 진피 섬유아세포 동결 섬유아세포를 동결시키려면 예열된 1x PBS 5mL로 세척합니다. PBS를 흡인하고 4mL의 1x 트립신-EDTA로 섬유아세포를 해리합니다. 플라스크를 다시 인큐베이터에 넣고 5%CO2에서 37°C에서 5-7분 동안 인큐베이션합니다. 위상차 현미경을 사용하여 분리를 모니터링하고 플라스크 측면을 두드려 세포를 분리합니다. 분리된 셀을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 세포 배양 플라스크를 5mL의 신선하고 예열된 섬유아세포 배지로 세척합니다. 세척 매체를 원뿔형 튜브에 넣고 200 x g에서 20° C 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 2mL의 신선하고 예열된 섬유아세포 배지로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 셀 수를 세고 1 x 106 셀을 새 원추형 튜브로 옮깁니다. 200 x g 에서 5 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 90% 태아 송아지 혈청과 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 구성된 1mL의 차가운 섬유아세포 동결 배지로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 극저온으로 옮기고 냉동 용기에 넣고 -80°C에서 밤새 얼립니다. 장기간 보관하려면 다음날 액체 질소 탱크에 극저온 액체를 넣으십시오. 3. hiPSC를 생성하기 위한 섬유아세포의 에피솜 재프로그래밍 에피솜 재프로그래밍의 경우 통로 4에서 8까지 1.5 x 106 개의 섬유아세포를 사용합니다. 이 세포 수에 도달하려면 약 70%의 밀도로 2-3개의 250mL 플라스크를 사용하십시오. 재프로그래밍 전날 섬유아세포를 1:2 비율로 분할하여 증식 상태를 확인합니다. 따라서 배지를 흡인하고 플라스크당 5mL의 예열된 1x PBS로 플라스크를 세척합니다. PBS를 흡인하고 4mL의 1x 트립신-EDTA로 섬유아세포를 해리합니다. 플라스크를 다시 인큐베이터에 넣고 37°C 및 5%CO2에서 5-7분 동안 인큐베이션합니다. 위상차 현미경을 사용하여 분리를 모니터링하고 플라스크 측면을 두드려 플라스틱 표면에서 세포를 분리합니다. 분리된 세포를 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 세포 배양 플라스크를 5mL의 신선하고 예열된 섬유아세포 배지로 세척합니다. 세척 매체를 원뿔형 튜브에 넣고 200 x g에서 20° C 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 세포 펠릿을 6mL의 신선하고 예열된 섬유아세포 배지에 재현탁합니다. 플라스크당 5mL의 신선하고 예열된 섬유아세포 배지를 추가하여 6개의 새로운 세포 배양 플라스크를 준비합니다. 각 플라스크에 1mL의 섬유아세포 현탁액을 추가합니다. 플라스크를 다시 인큐베이터에 넣고 플라스크를 각 방향으로 세 번 움직여 세포를 고르게 분배합니다. 에피솜 재프로그래밍의 경우, hiPSC 배양에 적합한 10cm 세포 배양 플레이트 2개를 플레이트당 4mL의 저온 코팅 용액으로 코팅합니다. 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.참고: hiPSC를 배양하려면 다양한 세포 배양 플라스틱과 추가 세포외 기질 코팅이 필요합니다( 재료 표 참조). 섬유아세포에서 배지를 제거하고 플라스크당 10mL의 예열된 1x PBS로 세척합니다. PBS를 흡인하고 37°C에서 5-7분 동안 인큐베이션하여 플라스크 당 4mL의 1x 트립신-EDTA로 섬유아세포를 해리시킵니다. 위상차 현미경을 사용하여 분리를 모니터링하고 필요한 경우 플라스크 측면을 두드려 플라스틱 표면에서 세포를 분리합니다. 분리된 셀을 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 빈 플라스크를 예열된 섬유아세포 배지 6mL로 세척하여 나머지 세포를 수집하고 원뿔형 튜브에 웅덩이합니다. 200 x g 에서 5 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 세포 펠릿을 3mL의 신선하고 예열된 1x PBS에 재현탁합니다. 세포를 세고 1.5 x 106 개의 섬유아세포를 새로운 원추형 튜브에 옮깁니다. 200 x g 에서 5 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 5mL의 전기천공 배지에 재현탁하고 다시 원심분리합니다. 그 동안 코팅된 10cm 세포 배양 플레이트에서 코팅 용액을 흡인하고 예열된 섬유아세포 배지 7mL를 추가합니다. 원심분리 후, 상층액을 버리고, 250 μL에 1.5 x 106 세포의 농도를 갖는 전기천공 배지에 세포 펠릿을 재현탁한다. 250 μL 세포 현탁액을 4 mm 간격 거리의 전기천공 큐벳으로 옮긴다( 재료 표 참조). 각 플라스미드(pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) 4μg을 총 부피 50μL의 전기천공 배지에 추가하여 플라스미드 형질주입 혼합물을 준비합니다. 큐벳으로 옮기고 부드럽게 튕겨서 섞습니다. 280V에서 하나의 펄스로 전기 증착하십시오. 멸균 가위를 사용하여 피펫 팁을 절단하고 전기천공된 섬유아세포 125μL를 준비된 10cm 세포 배양 플레이트 각각에 옮깁니다. 플레이트를 모든 방향으로 세 번 교반하여 세포를 분배하고 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 방해 없이 5%CO2 로 37°C에서 밤새 인큐베이션한다. 죽은 세포를 제거하려면 다음날 배지를 7mL의 신선하고 예열된 섬유아세포 배지로 교체하십시오. 전기천공 후 2일 후에 배지를 hiPSC 배지로 변경하고 다음 20일 동안 격일로 교체합니다. 4. 생성된 hiPSC의 선택, 확장 및 품질 관리 전기천공 후 hiPSC 콜로니의 형성을 관찰하기 위해 10x 또는 20x 대물렌즈의 위상차 현미경을 사용하여 최소 20일 동안 매일 세포를 모니터링합니다. hiPSC 콜로니의 크기가 약 300μm이고 경계가 뚜렷하고 hiPSC가 높은 핵 대 몸체 비율을 나타내는 경우 hiPSC 콜로니는 선별을 통해 선택할 준비가 된 것입니다(그림 2B, C 및 그림 3). 채취 전에 hiPSC 배양에 적합한 96웰 플레이트를 웰당 100μL의 코팅 용액으로 코팅하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 펜으로 세포 배양 접시의 바닥에 관심있는 콜로니를 표시하십시오. 96웰 플레이트의 최종 준비를 위해 코팅 용액을 제거하고 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 예열된 hiPSC 배양 배지 100μL를 각 웰에 추가합니다. 예열된 1x PBS로 세포를 세척하고 죽은 세포를 제거하기 위해 선택하기 전에 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 신선하고 예열된 hiPSC 배양 배지를 추가합니다. hiPSC 콜로니를 선택하려면 게이지 바늘을 사용하고 각 콜로니에 그리드를 그려 hiPSC 콜로니를 작은 조각으로 나눕니다. 위상차 현미경을 사용하여 콜로니가 성공적으로 조각으로 나뉘어져 있는지 확인합니다. 100μL 피펫을 사용하여 준비된 96웰 플레이트로 옮깁니다. 콜로니의 긁힘과 손실을 방지하기 위해 세포를 건드리지 않고 콜로니 위에 피펫을 똑바로 세우십시오. 96-웰 플레이트를 5%CO2 로 37°C의 인큐베이터에 놓고 세포가 방해 없이 밤새 부착되도록 합니다. 따기가 성공하지 못할 경우를 대비하여 섬유아세포와 hiPSC 혼합물로 접시를 보관하십시오. 따라서 배지를 hiPSC 배양 배지로 변경하여 ROCK 억제제 Y27632를 제거하고 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 다음날, 96-웰 플레이트의 배지를 신선한 hiPSC 배지 200 μL로 교체하고 격일로 교체하였다. 다음날 96웰 플레이트를 모니터링하고 성공적으로 선별된 클론으로 웰을 표시합니다.참고: 첫 번째 시도 후 선별된 hiPSC 클론이 완전히 선택되지 않고 웰에서 섬유아세포가 발견될 수 있는 경우 96-웰에서 채취를 반복하거나 플레이트에서 섬유아세포를 긁어냅니다. 5. 선택된 hiPSC 클론의 확장 위상차 현미경을 사용하여 hiPSC 클론을 모니터링합니다. 선택한 hiPSC가 약 70% 밀도에 도달하면 hiPSC 클론을 확장할 준비가 된 것입니다. hiPSC 배양에 적합한 48웰 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 웰당 250μL의 코팅 용액으로 코팅합니다. 코팅 용액을 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 신선하고 예열된 hiPSC 배양 배지 200μL로 교체합니다. 96웰 플레이트에서 hiPSC를 분리하려면 1,000μL 피펫 팁으로 플라스틱 표면을 긁어냅니다. 분리된 hiPSC를 96웰 플레이트에서 48웰 플레이트로 옮깁니다. 다음날 배지를 신선하고 예열된 hiPSC 배지로 변경하여 죽은 세포 및 ROCK 억제제 Y27632를 제거하였다. hiPSC 클론이 약 70% 밀도에 도달하면 hiPSC를 24웰 플레이트로 옮깁니다. 따라서 hiPSC 배양에 적합한 24-웰 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 웰 당 400μL의 코팅 용액으로 코팅합니다. 코팅 용액을 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유한 신선하고 예열된 hiPSC 배양 배지 400μL로 교체합니다. 48개의 웰에서 배지를 흡인하고 예열된 500μL의 1x PBS로 세척합니다. PBS를 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 효소 세포 분리 용액 100μL로 교체하고 37°C에서 4분 동안 인큐베이션합니다. 1,000 μL 파이펫을 사용하여 플레이트에서 hiPSC를 헹굽니다. 해리된 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 빈 48-웰 플레이트를 10 μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 hiPSC 배양 배지로 세척하고 원뿔형 튜브에 풀링한다. 200 x g 에서 5 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 hiPSC 배양 배지 1mL에 hiPSC를 재현탁하고 24웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 5%CO2 에서 37°C의 인큐베이터에 넣고 플레이트를 모든 방향으로 3회 교반하여 세포를 분배하였다. 세포가 방해받지 않고 밤새 부착되도록하십시오. 다음날, 배지를 ROCK 억제제 Y27632가 없는 hiPSC 배지로 변경하였다.참고: hiPSC 클론이 약 70% 밀도에 도달하면 12웰 형식에 적합한 부피를 증가시켜 5.4-5.7단계를 반복하여 hiPSC를 12웰 플레이트로 옮깁니다. 12웰 플레이트의 hiPSC가 약 70% 밀도에 도달하면 hiPSC 클론을 6웰 형식을 위해 부피가 증가된 6웰 플레이트로 옮깁니다. 6. 선택된 hiPSC 클론의 동결 선택된 hiPSC 클론을 동결하려면 6웰 플레이트에서 배지를 흡인합니다. 웰을 2mL의 1x PBS로 세척합니다. 10μM Y27632를 함유하는 효소 세포 분리 용액 1mL로 hiPSC를 흡인하고 해리합니다. 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣고 37°C 및 5%CO2에서 4분 동안 인큐베이션합니다. 1,000μL 피펫을 사용하여 플레이트에서 hiPSC를 헹구고 분리된 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 플레이트를 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 신선하고 예열된 hiPSC 배양 배지 2mL로 세척합니다. 원뿔형 튜브에 넣고 200 x g 에서 20°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 신선하고 예열된 hiPSC 배양 배지 2mL로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 셀 수를 세고 1 x 106 셀을 새 원추형 튜브로 옮깁니다. 200 x g 에서 5 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고, 세포 펠릿을 1mL의 차가운 무혈청 hiPSC 동결 배지에 재현탁하고, -80°C에서 하룻밤 동안 냉동 용기를 사용하여 극저온 상태에서 동결합니다. 장기 보관을 위해 극저온 액체를 다음날 액체 질소 탱크에 넣으십시오. 7. HiPSC 품질 관리 hiPSC 형태의 특성화20x 대물렌즈의 위상차 현미경을 사용하여 특징적인 hiPSC 형태를 확인합니다. 재프로그래밍 후 세포 형태는 긴 방추형 섬유아세포에서 작고 둥근 hiPSC로 변화하여 뚜렷한 경계를 가진 콜로니에서 성장하는 높은 핵 대 체내 비율을 나타냅니다(그림 2C). hiPSC 콜로니가 너무 조밀하게 성장하여 자발적인 분화가 발생하면 피펫 팁을 사용하여 플레이트에서 분화된 부분을 긁어냅니다(그림 3). hiPSC는 증식률이 높기 때문에 신선하고 예열된 hiPSC 공급 배지를 매일 hiPSC 배양물에 공급하십시오. 면역형광 염색에 의한 다능성 마커의 특성 분석면역형광 염색을 통해 생성된 hiPSC의 만능 마커를 확인하기 위해 플라스틱 커버슬립을 24웰 플레이트에 넣고 37°C 및 5%CO2에서 1시간 동안 250μL의 코팅 용액으로 코팅합니다. 코팅 용액을 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 예열된 hiPSC 배양 배지 1mL로 교체합니다. 시드 1.9 x 1024 웰당 4개의 해리된 hiPSC. hiPSC를 방해 없이 37°C 및 5%CO2 에서 밤새 부착합니다. hiPSC의 해리에 대해서는 5.4-5.6단계를 참조하십시오. 다음날 배지를 ROCK 억제제 Y27632가 없는 hiPSC 배양 배지로 교체합니다. 염색을 위해, 세포를 1 mL의 예열 된 1x PBS로 세척 한 후, 실온에서 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 hiPSCs를 고정시킨다. 고정된 hiPSC를 1x PBS로 세척하고 실온에서 1시간 동안 웰당 200μL의 사전 배양 용액으로 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 1차 항체 Ki67(1:300), OCT3/4(1:200), SSEA4(1:100)를 항체 희석액에 희석합니다. 70% 에탄올로 플라스틱 호일을 세척하고 물통으로 채워진 염색 챔버에 넣습니다. 호일에 30μL 1차 항체 희석액 방울을 놓습니다. 고정된 샘플을 희석액에 거꾸로 놓고 4°C에서 밤새 배양합니다. 다음날 샘플을 1x PBS로 5분 동안 세 번 세척하고 호일의 깨끗한 부분에 2차 항체 희석액(1:1,000) 30μL 방울을 놓습니다. 희석액에 덮개 슬라이드를 거꾸로 놓습니다. 어두운 곳에서 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 배양 후 1x PBS로 5분 동안 3회 세척한다. DAPI가 포함된 장착 매체의 유리 슬라이드에 샘플을 장착합니다. 실온과 어두운 곳에서 밤새 건조시키고 컨포칼 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화합니다(그림 4). 박테리아 및 마이코플라스마 오염 배제박테리아 오염을 배제하기 위해 해리된 hiPSC 500μL를 예열된 Luria-Bertani(LB) 배지 5mL로 옮깁니다. hiPSC의 해리에 대해서는 5.4-5.6단계를 참조하십시오. 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다. LB 배지가 탁해 보이면 박테리아 오염이 발생했을 가능성이 있습니다. 셀을 버립니다. 마이코플라스마 오염을 배제하기 위해, 약 90%의 confluent hiPSCs가 있는 6개의 웰에서 2일 동안 교체되지 않은 배지를 수집하십시오. 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR)을 사용하여 마이코플라스마 오염을 검출합니다. 이를 위해 많은 상업용 마이코플라스마 검출 키트를 사용할 수 있습니다. 8. hiPSC를 족세포로 분화 성장 인자의 준비 및 저장10mM Y27632의 스톡 농도를 준비하려면 3.12mL의 멸균수에 10mg의 Y27632(분자량 320.26g/mol)를 재구성합니다. -20°C에서 분취량 100μL를 보관하고 세포 배양 배지에 1:1,000으로 희석하여 최종 농도가 10μM이 되도록 합니다. 30mM CHIR99021의 스톡 농도를 준비하기 위해 358.2μL의 멸균 DMSO에 5mg의 CHIR99021(분자량 465.34g/mol)을 재구성합니다. -20°C에서 분취량 50μL를 보관하고 세포 배양 배지에 1:10,000으로 희석하여 최종 농도 3μM에 도달합니다. 100μg/mL 액티빈 A의 스톡 농도를 준비하려면 0.1% 소혈청알부민(BSA)이 포함된 1x PBS 1mL에 액티빈 A 100μg을 재구성합니다. -20°C에서 분취량 100μL를 보관하고 세포 배양 배지에 1:2,000으로 희석하여 최종 농도가 50ng/mL가 되도록 합니다. 100μg/mL 뼈 형태 형성 단백질 7(BMP7)의 스톡 농도를 준비하려면 0.1% BSA가 포함된 멸균수 1mL에 BMP7 100μg을 재구성합니다. -20°C에서 분취량 100μL를 보관하고 세포 배양 배지에 1:2,000으로 희석하여 최종 농도가 50ng/mL가 되도록 합니다. 100μg/mL 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 스톡 농도를 준비하려면 1mL의 멸균수에 100μg의 VEGF를 재구성합니다. 분취액 100μL를 -20°C에서 보관하고 세포 배양 배지에 1:4,000으로 희석하여 최종 농도가 25ng/mL가 되도록 합니다. 10mM 스톡 농도의 올-트랜스 레티노산을 제조하기 위해, 3.33 mL의 멸균 DMSO에 10 mg의 올-트랜스 레티노산을 재구성한다. 분취량 100μL를 -20°C에서 보관하고 세포 배양 배지에 1:100으로 희석하여 최종 농도 0.5μM에 도달합니다. 중배엽 계통을 유도하기 위한 WNT 신호전달 경로의 활성화hiPSCs를 hiPSC 유래 족세포로 분화시키기 위해, 코팅 용액으로 hiPSC 배양에 적합한 세포 배양 플레이트 또는 플라스크를 37°C 및 5%CO2에서 1시간 동안 코팅하였다. 코팅 용액의 총 부피는 6-웰 배양 플레이트당 1 mL 또는 10 cm 세포 배양 플레이트당 4 mL이다. 배지를 흡인하고 예열된 1x PBS로 hiPSC를 세척합니다. PBS를 흡인하고, 6-웰 배양 플레이트 당 1 mL 또는 10 cm 세포 배양 플레이트 당 4 mL의 총 부피로 10 μM Y27632를 함유하는 효소 세포 분리 용액을 추가한다. 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣고 37°C 및 5%CO2에서 4분 동안 인큐베이션합니다. 1,000 μL 파이펫을 사용하여 플레이트에서 hiPSC를 헹굽니다. 분리 된 셀을 원추형 튜브로 옮깁니다. 플레이트를 10 μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 신선하고 예열된 hiPSC 배양 배지로 세척한다. 해리 시약을 중화하기 위해 원추형 튜브에 세척 매체를 풀링합니다. 200 x g 에서 5 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 10μM ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 신선하고 예열된 hiPSC 배양 배지 2mL로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 세고 1 x 104 hiPSCs/cm2를 시드합니다. 모든 방향으로 3회 교반하여 세포를 분배한다. hiPSC를 방해 없이 5%CO2 로 37°C에서 밤새 부착합니다. 다음날, 배지를 1x B27 보충제, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 3μM CHIR99021, 50ng/mL 액티빈 A 및 10μM ROCK 억제제 Y27632를 포함하는 예열 중배엽 분화 배지 2mL로 교체합니다. 네프론 전구 세포로의 분화2일 후, 중배엽 배지를 1x B27 보충제, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 3μM CHIR99021, 50ng/mL 액티빈 A 및 50ng/mL BMP7을 포함하는 예열 네프론 전구체 분화 배지 2mL로 변경합니다. 다음 14일 동안 격일로 매체를 교체하십시오.참고: 네프론 전구 세포는 증식하며 네프론 전구체 확장 배지에서 분화 7일 후에 계대 및 동결될 수 있습니다. 네프론 전구 세포를 분할하기 위해, hiPSC 배양에 적합한 세포 배양 플라스틱을 37°C에서 1시간 동안 코팅 용액으로 코팅한다. 코팅 용액을 네프론 전구체 확장 배지로 교체하십시오. 배지를 흡인하고 예열된 1x PBS로 세포를 세척합니다. PBS를 제거하고 세포를 1x 트립신-EDTA로 해리합니다. 37°C 및 5%CO2에서 5분 동안 인큐베이션한다. 위상차 현미경을 사용하여 세포의 분리를 모니터링합니다. 필요한 경우 플라스틱 측면을 두드려 표면에서 셀을 분리합니다. 플레이트에서 세포를 헹구고 원추형 튜브로 옮깁니다. 해리 시약과 동일한 부피의 예열 된 네프론 전구체 팽창 배지로 빈 플라스크 또는 플레이트를 세척하십시오. 원뿔형 튜브에 세척 매체를 웅덩이. 200 x g에서 5 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 2mL의 신선하고 예열된 네프론 전구체 확장 배지로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 추가 분화를 위해 세포를 계수하고 1.5 x 10cm2 당4개의 네프론 전구 세포를 시드한다.참고: 네프론 전구 세포를 동결하려면 1 x 106 세포를 1mL의 저온 무혈청 동결 보존 배지에 재현탁하고 냉동 상태로 옮깁니다. -80°C의 냉동 용기에서 하룻밤 동안 냉동하고 장기 보관을 위해 액체 질소 탱크로 옮깁니다. 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣고 모든 방향으로 3회 교반하여 세포를 고르게 분배합니다. 다음날 배지를 신선하고 예열된 네프론 전구체 분화 배지로 변경합니다. 세포가 분화될 때까지 격일로 배지를 네프론 전구세포 분화 배지에서 14일 동안 교체한다. hiPSC 유래 족세포로의 말단 분화배지를 흡인하고 1x B27 보충제, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 3μM CHIR99021, 50ng/mL 액티빈 A, 50ng/mL BMP7, 25ng/μL VEGF 및 0.5μM all-trans retinoic acid를 포함하는 예열 지세포 분화 배지 2mL를 추가합니다. 플레이트를 다시 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에 넣는다. 신선하고 예열된 족세포 분화 배지로 4일 동안 격일로 배지를 교체하십시오. 분화 후 배양액에 hiPSC-족세포를 유지하기 위해 10% 태아 송아지 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄을 함유한 족세포 유지 배지를 일주일에 두 번 세포에 공급합니다.참고: 말단 분화된 hiPSC-족세포는 더 이상 증식하지 않습니다. 그러나 최대 4주 동안 세포 배양에 보관할 수 있습니다. 냉동 네프론 전구 세포의 해동 및 확장hiPSC 배양에 적합한 새로운 세포 배양 플라스틱 플라스크를 37°C 및 5%CO2에서 1시간 동안 코팅 용액으로 코팅합니다. 코팅 용액을 5mL의 네프론 전구체 확장 배지로 교체합니다. 예열된 네프론 전구체 확장 배지 7mL가 있는 15mL 원뿔형 튜브를 준비합니다. 냉동된 세포를 약 20초 동안 움직이지 않고 수조에서 37°C에서 해동합니다. 세포의 절반이 해동되고 약간의 얼음이 남을 때 수조에서 cryovial을 꺼냅니다. 극저온 액체에 70% 에탄올을 뿌리고 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 해동된 세포를 예열된 네프론 전구체 확장 배지를 사용하여 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 1,000 μL 피펫을 사용하여 세포가 튜브 벽을 따라 매우 천천히 흐르도록 합니다. 빈 극저온 난을 1mL의 네프론 전구체 확장 배지로 세척하여 나머지 세포를 수집하고 원뿔형 튜브에 고입니다. 20°C에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리하고 세포 펠릿을 신선하고 예열된 네프론 전구체 확장 배지에 재현탁합니다. 해동된 세포를 코팅된 플라스크로 옮기고 다음날 배지를 신선하고 예열된 네프론 전구체 확장 배지로 변경합니다. 추가 분화 전에, 배지를 격일로 변경하여 네프론 전구체 확장 배지에서 세포가 증식하도록 하고, 단계 8.3.5부터 진행한다. 9. 면역형광염색에 의한 hiPSC 유래 족세포의 특성화 면역형광 염색을 통해 족세포 특이적 마커에 대한 분화된 족세포를 확인하려면 플라스틱 커버슬립을 24웰 플레이트에 넣고 250μL의 코팅 용액으로 37°C 및 5% CO2에서 1시간 동안 코팅합니다. 코팅 용액을 예열된 네프론 전구체 확장 배지 1mL로 교체합니다. 시드 24-웰 플레이트 당 2.5 x 104 해리된 네프론 전구 세포. 8.3.2 – 8.3.4 단계에서 네프론 전구 세포의 해리를 참조하십시오. 세포가 방해 없이 37°C 및 5% CO2에서 밤새 부착되도록 합니다. 다음날 배지를 예열된 네프론 전구체 분화 배지로 교체합니다. 세포가 분화될 때까지 격일로 배지를 네프론 전구세포 분화 배지에서 총 14일간, 족세포 분화 배지에서 추가로 5일 동안 배지를 교체하여 분화를 마칩니다. 최종 분화 후, 1 mL의 예열 된 1x PBS로 세포를 세척하십시오. 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 hiPSC-족세포를 고정합니다. 고정된 세포를 1x PBS로 세척하고 실온에서 1시간 동안 웰당 200μL의 사전 배양 용액으로 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 1차 항체 시냅토포딘(1:200), 포도신(1:100) 및 네프린(1:25)을 항체 희석액으로 희석하고 물 저장소가 있는 염색 챔버의 깨끗한 플라스틱 호일에 1차 항체 희석액 30μL를 놓습니다. 희석액에 고정된 hiPSC-족세포가 있는 덮개 슬라이드를 거꾸로 놓습니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 1x PBS로 5분 동안 3회 세척한다. 2차 항체(1:1,000)를 1x PBS로 희석하고 호일의 깨끗한 부분에 30μL 2차 항체 희석액 방울을 놓습니다. 희석액에 덮개 슬라이드를 거꾸로 놓습니다. 어두운 곳에서 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 배양 후 1x PBS로 5분 동안 3회 세척한다. DAPI가 포함된 장착 매체의 유리 슬라이드에 샘플을 장착합니다. 실온과 어두운 곳에서 밤새 말리십시오. 컨포칼 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화합니다.