Nötrofil fonksiyonuna hızlı bir genel bakış için bir dizi tarama tekniği
Summary
Bu protokol, farklı sinyal yollarından gelen fonksiyonları kapsamak için bir tarama yöntemi olarak kullanılacak bir dizi nötrofil fonksiyonel tahlil içerir. Protokol, hücre canlılığının, saflığının, reaktif oksijen türlerinin üretiminin, gerçek zamanlı göçün, fagositozun ve nötrofil hücre dışı tuzakların bir ön önerisinin ilk ve basit bir değerlendirmesini içerir.
Abstract
Nötrofiller, doğuştan gelen bağışıklık tepkisinde ilk savunma hatlarından biri olarak bilinir ve kemotaksis, ters göç, fagositoz, sitotoksik enzimlerin ve metabolitlerin degranülasyonu ve DNA’nın nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET’ler) olarak salınması gibi birçok özel hücresel işlevi yerine getirebilir. Nötrofiller sadece kendilerini sıkı bir şekilde düzenlemekle kalmaz, aynı zamanda bağışıklık sisteminin diğer bileşenlerinin düzenlenmesine de katılırlar. Taze nötrofiller terminal olarak farklılaştığından, kısa ömürlü olduğundan ve bireyler arasında oldukça değişken olduğundan, toplanan örneklerden en iyi şekilde yararlanmak önemlidir. Araştırmacıların, değerlendirilen belirli koşullardan etkilenebilecek birçok nötrofil fonksiyonuna genel bir bakışı değerlendirmek için genellikle tarama testleri yapmaları gerekir. Bu ihtiyacı karşılamak için normal yoğunluktaki nötrofillerin tek bir izolasyon sürecini takip eden bir dizi test geliştirildi ve hız, kapsamlılık, maliyet ve doğruluk arasında bir denge arandı. Sonuçlar, derinlemesine takip çalışmalarına akıl yürütmek ve rehberlik etmek için kullanılabilir. Bu prosedür ortalama 4 saat içinde gerçekleştirilebilir ve hücre canlılığının, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin, gerçek zamanlı göçün ve cam slaytlar üzerinde mayanın fagositozunun değerlendirilmesini içerir ve omik çalışmalar gibi daha ayrıntılı yaklaşımlar için yeterli hücre bırakır. Ayrıca, prosedür, ışık mikroskobu ile gözlenen hızlı panoptik boyamadan sonra, bu şekilde daha fazla çabanın faydalı olup olmayacağını belirtmek için yeterli olsa da, spesifik belirteçlerin eksikliği ile NET’lerin bir ön önerisini kolayca gözlemlemenin bir yolunu içerir. Test edilen fonksiyonların çeşitliliği, testler arasındaki ortak noktaları birleştirerek analiz süresini ve masraflarını azaltır. Prosedür NeutroFun Screen olarak adlandırıldı ve sınırlamaları olmasına rağmen, yukarıda belirtilen faktörleri dengeler. Ayrıca, bu çalışmanın amacı kesin bir test seti değil, her laboratuvarın kaynaklarına ve taleplerine göre kolayca ayarlanabilen bir kılavuzdur.
Introduction
Nötrofiller, insan kanında en bol bulunan doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir ve enfeksiyon ve iltihaplanmada önemli bir rol oynadıkları bilinmektedir ve doku hasarıbölgesine ilk ulaşan ilk müdahale ekipleridir 1. Son yıllarda, nötrofillerin çeşitli hastalıklarda ve homeostazı desteklemede oynadığı önemli rol giderek daha fazla kabul görmektedir2. Nötrofiller sadece kendilerini sıkı bir şekilde düzenlemekle kalmaz, aynı zamanda bağışıklık sisteminin diğer bileşenlerinin düzenlenmesine de katılırlar 3,4,5. Bu nedenle, nötrofillerin ve kemotaksis, ters göç6, fagositoz7, solunum patlaması8 ve nötrofil hücre dışı tuzakların (NET’ler) salınması7 gibi birçok olağandışı hücresel fonksiyonlarının araştırılması, analiz edilen belirli koşullar tarafından tetiklenen potansiyel nötrofil fonksiyonel, morfolojik veya moleküler değişikliklerin değerlendirilmesinin gerekli olduğu çok sayıda araştırma bağlamında zorunludur.
Yeni izole edilmiş nötrofiller terminal olarak farklılaşır, kısa ömürlüdür, oldukça dinamiktir ve kolayca aktive olur9. Bununla birlikte, nötrofil yanıtlarını etkilemeyen verimli bir depolama yöntemi henüz elde edilememiştir, bu da kesintisiz olması gereken çoklu tahlillerin gerçekleştirilmesini zorlaştırmaktadır. Ayrıca, sitometri ve/veya floresan boyama gerektiren tahlillere dayanan daha önce açıklanan fonksiyonel analizler10,11, nötrofilin geniş ve ilk değerlendirmesine ihtiyaç duyulduğunda uygun bir seçim olmayabilir.
Bu sorunları ele almak için bu protokol, hücre canlılığının, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin, gerçek zamanlı göçün ve fagositozun değerlendirilmesi de dahil olmak üzere tek bir izolasyon sürecini takiben gerçekleştirilebilecek bir dizi testi açıklar. NeutroFun Screen adı verilen bu prosedür, degranülasyon hariç önde gelen efektör aktivitelerini kapsayacak şekilde tasarlanmıştır ve 1 saatlik aktivasyon dahil olmak üzere ortalama 4 saatlik bir sürede tamamlanabilir. Ek olarak, kalan hücreler omik çalışmaları gibi daha ayrıntılı yaklaşımlar için kullanılabilir. Bu yöntemin avantajı, hız, kapsamlılık, maliyet ve doğruluk arasındaki dengede yatmaktadır.
Ayrıca, NET’lerin bir ön önerisini kolayca gözlemlemenin bir yolu vardır, belirli belirteçler olmadan, ancak bu yönde daha fazla çabanın yararlı olup olmayacağını belirtmek için yeterlidir. Test edilen fonksiyonların çeşitliliği, testler arasındaki ortak noktaları birleştirmeyi, analiz süresini ve masraflarını azaltmayı amaçlar. Bu yöntemin temel amacı, nötrofilin tepkisine genel bir bakışa izin veren hız, kapsamlılık, maliyet ve doğrulukla ilgili dengeli, işlevsel bir analiz sağlamak ve yeni uyaranların normal yoğunluklu nötrofiller üzerindeki etkilerini araştırmada yararlı bir ilk adım haline getirmektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nötrofiller, kısa ömürlü ve henüz dondurularak saklanamayan oldukça dinamik ve duyarlı hücrelerdir19, bu da biyolojilerinin araştırılmasını zorlaştırır. Bu nedenle, canlı, zenginleştirilmiş ve dinlenen nötrofiller elde etmek için dikkatli adımlar atmak önemlidir11,20. Bu çalışma, nazik ve minimal manipülasyonun yanı sıra aktivasyon adımına kadar düşük sıcaklıkların kullanımını vurgulayan yoğunluğa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar aşağıdaki finansman kuruluşlarını kabul eder: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP ve FINATEC.
Materials
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma – Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma – Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma – Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma – Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma – Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma – Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma – Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma – Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
- Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345 (2017).
- Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
- Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147 (2019).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
- El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
- Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
- Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770 (2021).
- Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
- Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
- Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
- Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
- Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
- Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991 (2021).
- Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41 (2019).
- Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316 (2019).
- Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
- Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153 (2019).
- Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
- Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637 (2021).
- Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
- Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
- Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
- Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
- Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106 (2021).
- Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27 (2021).
- Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582 (2020).
- Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
- Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
- Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
- Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
- Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
- Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
- Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790 (2020).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
- Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825 (2021).
- Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
- Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).
