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Abstract
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Protocol
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免疫与感染

호중구 기능에 대한 간략한 개요를 위한 일련의 스크리닝 기법

Published: February 09, 2024
doi:
10.3791/65329
, , , , , ,
1Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology,University of Brasilia, 2Institute of Physics,University of Brasilia

Summary

이 프로토콜은 다양한 신호 전달 경로의 기능을 포괄하는 스크리닝 방법으로 사용되는 호중구 기능 분석 세트를 특징으로 합니다. 이 프로토콜에는 세포 생존율, 순도, 활성 산소 종 생산, 실시간 이동, 식세포작용 및 호중구 세포외 트랩에 대한 예비 제안에 대한 초기 및 간단한 평가가 포함됩니다.

Abstract

호중구는 선천성 면역 반응의 첫 번째 방어선 중 하나로 알려져 있으며 화학주성, 역이동, 식세포작용, 세포독성 효소 및 대사 산물의 탈과립화, 호중구 세포외 트랩(NET)으로서의 DNA 방출과 같은 많은 특정 세포 기능을 수행할 수 있습니다. 호중구는 스스로 신호를 엄격하게 조절할 뿐만 아니라 면역 체계의 다른 구성 요소를 조절하는 데에도 참여합니다. 신선한 호중구는 말기에서 분화되고, 수명이 짧으며, 개인마다 매우 다양하기 때문에 수집된 샘플을 최대한 활용하는 것이 중요합니다. 연구자들은 종종 평가 중인 특정 조건의 영향을 받을 수 있는 많은 호중구 기능의 개요를 평가하기 위해 스크리닝 분석을 수행해야 합니다. 정상 밀도 호중구의 단일 분리 공정에 따른 일련의 테스트는 속도, 포괄성, 비용 및 정확성 간의 균형을 추구하여 이러한 요구를 해결하기 위해 개발되었습니다. 결과는 심층적인 후속 연구를 추론하고 안내하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차는 평균 4시간 내에 수행할 수 있으며 세포 생존율, 활성 산소종(ROS) 생산, 실시간 이동 및 유리 슬라이드에서 효모의 식균작용 평가가 포함되어 오믹스 연구와 같은 보다 자세한 접근 방식을 위한 충분한 세포를 남깁니다. 더욱이, 이 절차에는 광학 현미경으로 관찰된 빠른 panoptic 염색 후 NET의 예비 제안을 쉽게 관찰할 수 있는 방법이 포함되어 있으며, 특정 마커가 부족하지만 이러한 방식으로 추가 노력을 기울일 가치가 있는지 여부를 나타내기에 충분합니다. 테스트된 기능의 다양성은 테스트 간의 공통점을 결합하여 분석 시간과 비용을 줄입니다. 이 절차는 NeutroFun Screen으로 명명되었으며 한계가 있지만 앞서 언급한 요소의 균형을 맞춥니다. 또한 이 작업의 목적은 명확한 테스트 세트가 아니라 각 실험실의 리소스와 요구 사항에 맞게 쉽게 조정할 수 있는 지침입니다.

Introduction

호중구는 인간의 혈액에서 가장 풍부한 선천성 면역 세포로, 감염과 염증에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 조직 손상 부위에 가장 먼저 도착한다1. 최근 몇 년 동안 호중구가 다양한 질병과 항상성을 지원하는 데 중요한 역할을 한다는 인식이 높아지고있습니다 2. 호중구는 스스로 신호를 엄격하게 조절할 뿐만 아니라 면역 체계의 다른 구성 요소의 조절에도 참여합니다 3,4,5. 따라서 호중구와 호중구의 많은 특이한 세포 기능(예: 화학주성, 역이동6, 식세포작용7, 호흡파열8, 호중구 세포외 트랩(NET)7 방출)을 조사하는 것은 분석 중인 특정 조건에 의해 유발되는 잠재적인 호중구의 기능적, 형태학적 또는 분자적 변화를 평가해야 하는 수많은 연구 상황에서 필수적입니다.

갓 분리된 호중구는 말기 분화되고, 수명이 짧으며, 매우 역동적이고, 쉽게 활성화된다9. 그러나 호중구 반응에 영향을 미치지 않는 효율적인 보관 방법은 아직 달성되지 않았기 때문에 중단 없이 여러 분석을 수행하는 것이 어렵습니다. 더욱이, 세포 분석 및/또는 형광 염색을 필요로 하는 분석에 기초한 이전에 기술된 기능 분석(10,11)은 호중구의 광범위하고 초기 평가가 필요한 경우 실행 가능한 선택이 아닐 수 있다.

이러한 문제를 해결하기 위해 이 프로토콜은 세포 생존율, 활성산소종(ROS) 생산, 실시간 이동 및 맥주효모균의 식세포작용 평가를 포함하여 단일 분리 프로세스 후에 수행할 수 있는 일련의 테스트를 설명하며, 그 결과는 심층 후속 연구를 추론하는 데 사용할 수 있습니다. NeutroFun Screen이라고 명명된 이 절차는 탈과립을 제외한 주요 이펙터 활동을 포함하도록 설계되었으며 활성화 1시간을 포함하여 평균 4시간 내에 완료할 수 있습니다. 또한 나머지 세포는 오믹스 연구와 같은 보다 상세한 접근 방식에 사용할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 속도, 포괄성, 비용 및 정확성 간의 균형에 있습니다.

또한 특정 마커 없이 NET의 예비 제안을 쉽게 관찰할 수 있는 방법이 있지만 해당 방향으로의 추가 노력이 가치가 있는지 여부를 나타내기에 충분합니다. 테스트되는 기능의 다양성은 테스트 간의 공통점을 결합하여 분석 시간과 비용을 줄이는 것을 목표로 합니다. 이 방법의 주요 목표는 호중구의 반응에 대한 개요를 허용하는 속도, 포괄성, 비용 및 정확도에 관한 균형 잡힌 기능적 분석을 제공하여 정상 밀도 호중구에 대한 새로운 자극의 영향을 조사하는 데 유용한 초기 단계가 되는 것입니다.

Protocol

모든 실험은 브라질리아 대학의 기관 검토 위원회에서 정한 윤리 지침(프로세스 13364819.0.0000.5558)을 엄격히 따랐으며, 샘플은 기증자의 익명성을 보장하기 위해 코드로 식별되었습니다. 세포는 정보에 입각한 동의서에 서명하고 비흡연자/베이퍼, 만성 질환 없음, 지난 14일 동안 염증성 질환 병력이 없는 18-35세의 건강한 남성 기증자로부터 얻었습니다. 1. 채혈 <ol…

Representative Results

이 연구에서 사용된 밀도 기반 분리 방법(그림 1)은 제안된 실험의 기준을 충족했습니다. 이 방법에서 얻은 호중구 매개변수에는 생존율≥98%, 순도 ≥94% 및 세포 수율 ≥1.5 x 107이 포함되었으며 스크리닝 테스트로 활성화가 감지되지 않았습니다. PMN 분리의 두 가지 관련 단계는 항응고와 적혈구 제거입니다. 밀도 구배 위에 겹겹이 쌓이기 전에 항응고 혈액 튜브 또는 …

Discussion

호중구는 수명이 짧고 아직 냉동 보존할 수 없는 매우 역동적이고 반응성이 뛰어난 세포입니다19 따라서 생물학에 대한 조사가 어렵습니다. 그러므로, 생존 가능하고, 풍부하고, 안정된 호중구를 얻기 위해 신중한 단계를 따르는 것이 필수적이다11,20. 이 연구는 부드럽고 최소한의 조작과 활성화 단계까지 저온의 사용을 강조하는 밀도…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP 및 FINATEC과 같은 자금 지원 기관을 인정합니다.

Materials

CIM-Plate 16 Agilent  5665825001
CLARIOstar Plate Reader  BMG LABTECH US Patent Number 9,733,124
Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide Dinâmica 1582
DNAse I Sigma – Aldrich DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma – Aldrich E5134
Fast panoptic stain Laborclin 620529
Glass slide Exacta 7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. Sigma – Aldrich 55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. Sigma – Aldrich H4641
Heparin Blau  7896014655229
Laminar flow cabinet Veco VLFS-12
Microscope Zeiss 415501-0101-002 Product details: Primostar 1
Mixing Block BIOER MB-102
Neubauer improved bright-lined New Optik 1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine Sigma – Aldrich F3506
Nitroblue tetrazolium Neon CAS 298-83-9
Percoll Cytiva 17089101 separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma – Aldrich P8139
Phosphate buffered saline tablet Sigma – Aldrich P4417
ROTOFIX 32 A Hettich 1206
Saccharomyces cerevisiae Fleischmann
Safranin Sigma – Aldrich 50240
Sodium dodecyl sulfate Cytiva 17-1313-01
Sonicator Qsonica Q125
Trypan blue solution Vetec C.I. 23850
Vortex Genie 2 Scientific Industries, Inc. 0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) Agilent  380601050 Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software
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References

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Souza Luz, I., Takaya, R., Gonzaga Ribeiro, D., Sales Silva, N., Fontes, L., Castro, M. S., Fontes, W. A Set of Screening Techniques for a Quick Overview of the Neutrophil Function. J. Vis. Exp. (204), e65329, doi:10.3791/65329 (2024).
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