Misurazioni in tempo reale dei parametri di calcio e contrattilità in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo
Summary
Qui, viene descritto un metodo consolidato per eseguire misurazioni della contrattilità e del calcio in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando una piattaforma basata sull’ottica. Questa piattaforma consente ai ricercatori di studiare l’effetto delle mutazioni e la risposta a vari stimoli in modo rapido e riproducibile.
Abstract
I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-CMs) rappresentano un potente strumento per studiare i cambiamenti mediati da mutazioni nella funzione dei cardiomiociti e definire gli effetti dei fattori di stress e degli interventi farmacologici. In questo studio, è dimostrato che questo sistema basato sull’ottica è un potente strumento per valutare i parametri funzionali di hiPSC-CM in 2D. Utilizzando questa piattaforma, è possibile eseguire misurazioni accoppiate in un ambiente di temperatura ben conservato su diversi layout di piastre. Inoltre, questo sistema fornisce ai ricercatori un’analisi istantanea dei dati.
Questo articolo descrive un metodo per misurare la contrattilità di hiPSC-CM non modificati. La cinetica di contrazione viene misurata a 37 °C in base alle variazioni di correlazione dei pixel rispetto a un sistema di riferimento preso al rilassamento a una frequenza di campionamento di 250 Hz. Inoltre, le misurazioni simultanee dei transitori intracellulari del calcio possono essere acquisite caricando la cellula con un fluoroforo sensibile al calcio, come Fura-2. Utilizzando un iperinterruttore, è possibile eseguire misurazioni raziometriche del calcio su un punto di illuminazione di 50 μm di diametro, corrispondente all’area delle misurazioni di contrattilità.
Introduction
L’insufficienza cardiaca è la principale causa di morte in tutto il mondo. Nel 2019, le malattie cardiovascolari hanno causato 18,6 milioni di decessi a livello globale, il che riflette un aumento del 17,1% negli ultimi dieci anni1. Nonostante gli sforzi dei ricercatori per identificare bersagli farmacologici per prevenire e curare l’insufficienza cardiaca, i risultati dei pazienti sono ancora scarsi2. La differenza nella fisiopatologia dei modelli animali rispetto all’uomo potrebbe essere uno dei fattori alla base del limitato successo per l’ottimizzazione della terapia dello scompenso cardiaco3. Ulteriori modelli simili all’uomo sono garantiti per modellare la malattia e testare la tossicità e l’efficacia di nuovi composti farmacologici.
I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSC-CMs) rappresentano un potente strumento per definire i meccanismi patologici cellulari indotti da fattori di stress, ischemia, metabolismo alterato o varianti genetiche patogene e l’efficacia e la tossicità degli interventi farmacologici4. Per definire gli effetti sulle proprietà funzionali delle hiPSC-CM, è necessario un sistema ad alta velocità che misuri le proprietà sistoliche e diastoliche delle contrazioni cellulari in modo imparziale e riproducibile. Questo obiettivo generale del presente studio è dimostrare che un sistema basato sull’ottica è un potente strumento per eseguire analisi in tempo reale dei parametri funzionali degli hiPSC-CM.
Attualmente, ci sono più piattaforme per valutare la contrattilità degli hiPSC-CM. Tuttavia, i sistemi attuali offrono una lettura lenta o il numero richiesto di celle potrebbe essere una sfida. I sistemi di misurazione video senza etichette5,6 si basano sull’analisi post-hoc dei video, che richiede molto spazio di archiviazione e manca di feedback diretto durante l’acquisizione video. Inoltre, una risoluzione temporale e spaziale sufficiente è difficile da raggiungere e può comportare un sottocampionamento. Altri metodi per determinare le proprietà dei cardiomiociti, come le brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) / Cas9-edited hiPSC-CMs7 con reporter fluorescenti potrebbero interferire con la stabilità genica delle cellule e richiedere competenze di laboratorio specializzate.
Per superare i limiti sopra menzionati, in questo studio è stato sviluppato e introdotto un sistema di misurazione basato sull’ottica unico. Questa piattaforma consente misurazioni di contrattilità su hiPSC-CM non modificati semplicemente riplaccandoli su qualsiasi formato di piastra richiesto, senza alcuna limitazione nelle dimensioni della piastra. Inoltre, le misurazioni in tempo reale consentono l’osservazione diretta e l’analisi dei parametri funzionali delle hiPSC-CM, fornendo quindi un’impostazione sperimentale per regolare e ottimizzare istantaneamente i protocolli. Inoltre, viene memorizzata la posizione di ciascuna misurazione, il che consente misurazioni accoppiate sullo stesso campione, aumentando così la potenza degli esperimenti.
Per dimostrare il sistema basato sull’ottica, sono state eseguite misurazioni di contrattilità su una linea di controllo hiPSC-CM. Questa linea di controllo hiPSC è stata generata dal fibroblasto dermico di un donatore maschio sano concariotipo 8 normale. La cinetica di contrazione è stata misurata a 37 °C, sulla base dei cambiamenti di correlazione dei pixel rispetto a un sistema di riferimento preso durante il rilassamento a una frequenza di campionamento di 250 Hz. Poiché l’inizio esatto della contrazione non può sempre essere determinato in modo univoco, il punto temporale in cui è stato raggiunto il 20% dell’altezza del picco (tempo al picco 20%) è stato preso come punto di partenza per le misurazioni del tempo al picco. In questo modo, è stata riscontrata una minore variabilità per questo parametro all’interno di un campione. Allo stesso modo, poiché il momento esatto in cui il segnale ritorna alla linea di base è difficile da valutare, il tempo necessario per raggiungere l’80% del ritorno alla linea di base dal picco (tempo al basale 80%) è stato utilizzato per descrivere il tempo di rilassamento.
Le misurazioni complessive della contrattilità includevano le frequenze di battito a riposo, il tempo dal picco del 20% alla contrazione del picco (TP. Con), e il tempo dalla contrazione del picco all’80% del basale (TB. Con80) (Figura 1B). Per testare l’effetto di un fattore di stress, le cellule sono state incubate con isoprenalina (ISO). Inoltre, in coincidenza con le misure di contrattilità, i transitori Ca 2+ sono stati misurati caricando le celle con estere Fura-2-acetossimetil (Fura-2 AM) ad una frequenza di campionamento di 250 Hz. Le misurazioni raziometriche Ca2+ 9 utilizzando un iperinterruttore sono state eseguite su un’area di illuminazione di 50 μm di diametro, corrispondente all’area delle misurazioni di contrattilità. I dati di misurazione di Ca 2+ sono rappresentati come il tempo dal picco del 20% al picco nel transitorio Ca2+ (TP.Ca) e il tempo dal picco all’80% della linea di base (TB.Ca80) (Figura 1C). È stato utilizzato uno strumento di analisi dei dati rapido e automatico per produrre parametri contrattili e cinetici di calcio medi per ciascuna area.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, viene descritto un metodo per eseguire misurazioni transitorie di contrattilità e calcio su hiPSC-CMs e studiare l’effetto di fattori di stress / farmaci su queste cellule. Le misurazioni della contrattilità, le misurazioni raziometriche del calcio e la risposta all’ISO sono state eseguite su tre diversi cicli di differenziazione come repliche biologiche. Per ogni replica biologica, le misurazioni sono state eseguite su tre pozzi come repliche tecniche. Il motivo per eseguire le misurazioni in questo modo era quello di garantire che la variabilità biologica e la variabilità tecnica del campione e della piattaforma potessero essere valutate. Oltre a considerare il numero appropriato di repliche biologiche e tecniche, la condizione di coltura hiPSC-CM potrebbe svolgere un ruolo importante per ottenere risultati costanti e robusti. È importante essere coerenti con criteri, quali l’età delle hiPSC-CM, la composizione del mezzo, le condizioni di riplaccatura e il tempo di incubazione del composto durante le misurazioni. In questo studio, ci sono voluti in media 568 ± 24 s per misurare 11 aree due volte per 10 s in un pozzetto. Ciò include un tempo di incubazione ISO di 79 ± 11 s. Questo si riduce a circa 10 minuti per pozzetto, che dovrebbe consentire ai ricercatori di misurare una piastra completa da 24 pozzetti in ~ 4 ore. Il controllo del clima viene utilizzato per mantenere stabile la CO2. Ciò consente di misurare l’effetto di composti / fattori di stress su hiPSC-CM in modo ad alta velocità.
Per misurare la funzione contrattile delle iPSC-CM, esistono diversi sistemi che si basano sull’optogenetica13 o sulla microscopia senza etichetta basata su video 5,6. I sistemi optogenetici sono piuttosto complessi e richiedono tecniche speciali per ottenere dati elettrofisici e/o di contrattilità. Altri sistemi si basano sull’analisi post-hoc dei video, che richiede molto spazio di archiviazione e manca di feedback diretto durante l’acquisizione video. Inoltre, è difficile ottenere una risoluzione temporale e spaziale sufficiente, il che può comportare un sottocampionamento. Allo stesso modo, gli hiPSC-CM modificati da CRISPR / CAS-9 con reporter fluorescenti7 possono introdurre effetti indesiderati sul comportamento dei cardiomiociti. Anche l’uso di coloranti fluorescenti per le misurazioni di contrazione-rilassamento è un approccio elegante, ma limita l’esecuzione di esperimenti sullo stesso campione per un periodo più lungo14.
Questa piattaforma di misurazione basata sull’ottica, tuttavia, potrebbe essere utilizzata per misurare i tempi di contrazione-rilassamento senza utilizzare alcun colorante fluorescente o metodi invasivi. Tuttavia, poiché la correlazione dei pixel non fornisce informazioni spaziali, questo metodo non può essere utilizzato per misurare la forza della contrazione, ma piuttosto può solo rilevare in modo affidabile i cambiamenti nella velocità di contrazione e rilassamento. Il sistema di misura introdotto è a temperatura controllata e può acquisire dati di calcio e contrattilità in tempo reale con una risoluzione di >200 fotogrammi al secondo. Inoltre, viene memorizzata la posizione di ciascuna misurazione, che consente misurazioni accoppiate, aumentando così la potenza degli esperimenti. Inoltre, questa piattaforma offre ai ricercatori la possibilità di archiviare i dati e analizzarli immediatamente dopo l’esperimento. Nel complesso, questo sistema di misurazione basato sull’ottica dimostra di essere un metodo promettente per studiare i meccanismi patologici cellulari, può valutare l’effetto dei composti sulla funzionalità delle hiPSC-CM e può essere utile con il processo preclinico nello screening dei farmaci.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata in parte dalla sovvenzione Eurostars Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK) e dalla sovvenzione NWO-VICI 91818602 (JV).
Materials
| µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm | ibidi | 82421 | |
| B-27 Supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| CytoSolver transient analysis tool | CytoCypher | A fast automatic data analysis tool | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fura-2, AM | Thermo Fisher | F1221 | |
| Isoprenaline hydrochloride | Merck | 15627 | |
| KnockOut™ Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828010 | |
| Matrigel | Merck | CLS3542C | Basement membrane |
| MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software | CytoCypher | Optics-based measurement system | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher | 11875119 | |
| Tyrode | Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2 |
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