在多重血清学检测中同时检测不同抗体类别

在该实验系列中使用人类血清样本已获得适当的机构审查委员会/伦理委员会批准。样本是来自德国 SARS-CoV-2 血清阳性率14 国家研究的匿名残留材料。德国汉诺威医学院伦理委员会（9086_BO_S_2020）批准了使用人类样本。本研究共使用了 21 份人类血清样本。 1. 使用人体样本的伦理批准 获得使用人体样本的适当伦理批准。 2.试剂和设备 人血清样本：使用先前诊断为莱姆疏螺旋体病或已证实为疏螺旋体阴性免疫状态的人的血清样本进行技术测定验证和质量控制12,14。 单报告器检测。使用双通道单报告仪器（材料表）进行初始检测开发和技术验证。注：单报告系统有两个激光器：1） 识别和量化微珠组特异性荧光以区分不同的微珠组（如果使用）（分类通道），以及 2） 检测和定量微珠结合的靶标特异性藻红蛋白 （PE） 荧光（报告通道;532 nm 激发，“橙色”565-585 nm 发射）。因此，使用单个报告通道一次只能分析单个抗体同种型类别（例如，IgG 或 IgM）。进行初步验证研究，分别评估抗疏螺旋体 IgG 和 IgM，采用单报告基因 96 孔形式，对两种抗体类别均使用 PE 标记的检测试剂。注：目前的检测评估了对 疏螺旋体 抗原 VlsE 和两种 DbpA 变体具有特异性的循环 IgG，以及对抗原 OspC 具有特异性的循环 IgM，作为代表性示例。该测定可以扩展以评估针对其他抗疏螺旋体 抗原的血清免疫反应性，如所需12。 双报告器仪器。使用允许在同一反应中同时进行 IgG/IgM 分析的三通道双报告基因仪器（材料表），用于开发和技术验证双 IgM/IgG 检测（详见下文）。该仪器共有 3 个荧光检测通道，其中 2 个是评估靶向 Ig 相关信号的报告通道。注：双报告系统有三个激光器：1）识别和量化珠组特异性荧光（分类通道）;2） 检测和定量靶标特异性藻红蛋白 （PE） 荧光（报告通道 1;532 nm 激发，“橙色”565-585 nm 发射），以及 3） 评估第二个靶标分析物的靶标特异性亮紫 421 （BV421） 荧光（报告通道 2;405 nm 激发，“蓝色”421-441 nm 发射）。双报告基因系统兼容 96 孔和 384 孔微量滴定板（半自动处理）检测形式。一般测定方案如 图1所示。协议步骤详述如下。 3. 抗原偶联 将 疏螺旋体 抗原偶联到磁性、羧化和荧光颜色编码的 6.5μm 微球（珠子; 材料表）使用 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺 （EDC）/磺基-N-羟基琥珀酰亚胺 （sNHS） 化学。注：详细说明可在参考文献11和参考文献12 中找到。在表1中找到每种抗原的偶联浓度。偶联珠应在4°C下避光储存直至使用。偶联和检测反应中使用的所有缓冲液均详见 补充材料。 4.检测程序：单报告基因IgG或IgM血清学检测：96孔形式 分 2 步稀释样品（2 步，均在 96 孔板中;在测定缓冲液中稀释 200 倍血清样品）。注：测定缓冲液组合物是含有 1% （w/v） 牛血清白蛋白的低交叉缓冲液：PBS 的 1：4 混合物。将吐温-20加入到混合物中，至终浓度为0.05%（v / v）。样品稀释步骤 1：将 5 μL 血清样品与 120 μL 测定缓冲液（25 倍稀释）混合。 样品稀释步骤 2：通过将 10 μL 稀释液与 70 μL 测定缓冲液混合，将 25 倍的样品稀释液再稀释 8 倍，使最终样品稀释 200 倍。 磁珠混合物稀释制备每个微珠群（即每个唯一靶抗原）含有 1.0 ×10 个 6 个微珠/mL 的微珠混合物。 在测定缓冲液中将制备的微珠混合物稀释 25 倍，使该稀释悬浮液中的最终微珠浓度现在为每个微珠群 4 ×10 个 4 个微珠/mL（即每个独特的靶抗原）。 血清样品与珠子孵育将 25 μL 稀释的偶联多重微珠悬浮液（含 4.0 ×10 个 4 个微珠/组/mL）移液到 96 孔半面积微量滴定板（材料表）的指定孔中。 将 25 μL 200 倍稀释的血清样品（来自上述步骤 4.1）加入含有 25 μL 偶联微珠悬浮液的适当孔中。注意：这会产生额外的 2 倍稀释，因此孔中的最终血清样品稀释度为 400 倍，最终微珠计数为 1000 个微珠/微珠组/50 μL 反应。 用微孔板密封件（粘合剂箔或塑料板盖）覆盖96孔反应板。 在板振荡器上以750rpm在20°C下孵育板2小时。 珠子清洗从板振荡器上取下 96 孔反应板，小心地取下粘合板密封件。 将 96 孔反应板放入洗板机中。 使用自动磁性洗板机用 100 μL 洗涤缓冲液 （1× PBS + 0.05% v/v Tween 20） 洗涤珠子 3 次。 将洗涤过的珠子重悬于100μL洗涤缓冲液中，用粘性箔或塑料板盖覆盖板，并在20°C下以1000rpm在板振荡器上摇动板1分钟。 劈开洗过的珠子从板振荡器上取下 96 孔反应板，小心地取下粘合板密封件。 通过上下移液五次混合反应，并将每个 100 μL 反应体积的 50 μL 转移到两个新的 96 孔反应板中，一个用于 IgG 检测，一个用于 IgM 检测。 检测抗体/试剂孵育注意：此时，靶抗原偶联微珠已与血清样品一起孵育，以提取血清（如果存在）中与抗原反应的循环抗体。与结合的免疫球蛋白的反应微球已被分成两个板，现在使用带有 PE 标记的同种型特异性二抗在其单独的板中检测和定量 IgG 和 IgM。错开板处理 20 分钟。使用磁性板垫圈从含有磁珠的孔中吸出上清液。 对于每个板，在测定缓冲液中制备适当的 Ig 检测试剂混合物（抗 IgG 或抗 IgM），其中含有 PE 偶联的山羊抗人 IgG （3 μg/mL） 或 PE 偶联的驴抗人 IgM （5 μg/mL）。对于每个含微珠的孔，使用 30 μL 检测试剂。为反应孔准备足够的 IgG 和 IgM 检测试剂体积，并有足够的额外体积来适应移液损失。 将 30 μL IgG 检测试剂移液到 IgG 板上含有反应珠的每个孔中，并用微孔板密封盖住 96 孔反应板。 将 30 μL IgM 检测试剂移液到每个孔中，其中包含 IgM 板上的反应珠，并用微孔板密封盖住 96 孔反应板。 在20°C下孵育45分钟，同时在板振荡器上以750rpm振荡。 珠子清洗从板振荡器上取下 96 孔反应板，小心地取下粘合板密封件。 将 96 孔反应板放入磁性洗板器中。 使用磁性洗板机用 100 μL 洗涤缓冲液洗涤珠子 3 次。 将珠子重悬于 100 μL 洗涤缓冲液中。 在单个报告基因仪器上分析结果。用微孔板密封盖住96孔反应板。 在板振荡器上以1000rpm在20°C下摇动96孔反应板3分钟。 将 96 孔反应板从板振荡器中转移出来，并放入单报告器流量分析仪（材料表）。 对于每个样品，使用以下仪器设置分析中值荧光强度 （MFI）：摄取体积 = 80 μL，计数 = 50/微珠群，超时 = 60 秒，门控 = 7,500-15,000）12,13。 5. 检测程序：双报告基因 IgG 和 IgM 血清学检测：96 孔形式 样品稀释（2 个步骤，均在 96 孔板中;在测定缓冲液中稀释 200 倍血清样品）样品稀释步骤 1：将 5 μL 血清样品与 120 μL 测定缓冲液混合（稀释 25 倍）。 样品稀释步骤 2：通过将 10 μL 第一次稀释液（第 5.1.1 节中的 25 倍稀释样品）与 70 μL 测定缓冲液（8 倍稀释）混合，将 25 倍样品稀释液再稀释 8 倍，以获得最终样品稀释至 200 倍。 磁珠混合物稀释制备每个微珠群（即每个唯一靶抗原）含有 1.0 ×10 6 个靶抗原偶联微珠/mL 的微珠混合物。注：在本实验系列中，我们评估了每次反应中对四种独特 疏螺旋体 抗原的 IgG 和 IgM 免疫反应性。 将制备的微珠混合物在测定缓冲液中稀释 50 倍。该稀释悬浮液中的微珠浓度现在为每微珠群 2.0 ×10 4 个微珠/mL。注：在初步研究证实荧光信号保持在使用一半数量的微珠后，双链检测反应中的微珠数量比单报告基因反应中使用的微珠数量减半，以允许两种测定之间的直接可比性并节省资源。 血清样品与珠子孵育将 25 μL 稀释的靶抗原偶联微珠悬浮液（含 2.0 ×10 个 4 个微珠/组/mL）移液到 96 孔半面积微量滴定板的预分配孔中。反应孔的确切数量及其在板上的位置取决于操作员确定的测试样品总数以及每个样品是运行单孔还是重复孔。注意：靶抗原偶联磁珠将与人血清样本反应。如果样本中存在抗疏螺旋体 抗原免疫反应性 IgG 和 IgM，它们都会结合并固定在相同的抗原偶联微珠上。然后，将在相同的反应中对相同的磁珠进行结合的 IgG 和 IgM 的二抗定量，使用不同的荧光团进行 IgG 和 IgM 鉴定，从而允许它们进行区分。 向每个含有 25 μL 混合靶标抗原偶联微珠悬浮液（步骤 5.2）的孔中加入 25 μL 200 倍稀释的血清（来自上述步骤 5.1）。注意：这会产生额外的 2 倍稀释，因此孔中的最终血清样品稀释度为 400 倍，最终微珠计数为 500 个微珠/微珠组/50 μL 反应。 用微孔板密封件（粘合箔或塑料板盖）覆盖96孔反应板。 在20°C，750rpm的板振荡器上用珠子孵育板2小时。 珠子清洗（去除多余的血清样本）从板振荡器上取下 96 孔反应板并取下粘合板密封件。 将 96 孔反应板放入磁性洗板器中。 使用磁性洗板机用 100 μL 洗涤缓冲液洗涤珠子 3 次。 在最后一个洗涤步骤后，从珠子中吸出最终洗涤体积。 检测抗体（孵育 – 第一部分）在测定缓冲液中制备含有生物素化山羊抗人 IgG （1 μg/mL） 和 PE 偶联驴抗人 IgM （5 μg/mL） 的新鲜 IgG 和 IgM 双重检测试剂。对于每个含微珠的孔，使用 30 μL 双检测试剂。为反应孔准备足够的 IgG 和 IgM 双检测试剂体积，并有足够的额外体积来适应移液损失。 将 30 μL IgG 和 IgM 双重检测试剂移液到每个指定的孔中，并用微孔板密封盖住 96 孔反应板。 将板在20°C孵育45分钟，同时在板振荡器上以750rpm振荡。 微珠清洗（去除多余的检测抗体）从板振荡器上取下 96 孔反应板，小心地取下粘合板密封件。 将 96 孔反应板放入自动磁性洗板机中。 使用自动磁性洗板机用 100 μL 洗涤缓冲液洗涤珠子 3 次。 在最后一个洗涤步骤后，从珠子中吸出最终洗涤体积。 链霉亲和素偶联报告基因（孵育 – 第 II 部分）在测定缓冲液中将新鲜的 BV421 标记的链霉亲和素稀释至 0.2 μg/mL 的浓度。对于每个含珠子的孔，使用 30 μL BV421 标记的链霉亲和素。为反应孔准备足够的 BV421 标记的链霉亲和素体积，并有足够的额外体积来适应移液损失。 将 30 μL 稀释的 BV421-链霉亲和素移液到每个反应孔中，并用微孔板密封盖住 96 孔反应板。 将板在20°C孵育30分钟，同时在板振荡器上以750rpm振荡。 清洗珠子（去除多余的BV421-链霉亲和素）从板振荡器上取下 96 孔反应板，小心地取下粘合板密封件。 将 96 孔反应板放入磁性洗板机中。 使用自动磁性洗板机用 100 μL 洗涤缓冲液洗涤珠子 3 次。 在洗涤缓冲液中将微珠重悬于孔内至最终体积为 100 μL。 在双报告器仪器上分析结果用微孔板密封盖住96孔反应板。 将96孔反应板在20°C，1000rpm的板振荡器上孵育3分钟。 将 96 孔反应板从板振荡器转移到双报告器流量分析仪（材料表）。 根据制造商说明评估样品中位荧光强度 （MFI）（仪器设置：双报告模式，摄取体积 = 80 μL，计数 = 50/珠群，超时 = 60 秒，门控 = 7,500-15,000）。 6. 双报告基因 IgG 和 IgM 血清学检测：384 孔半自动形式 使用第 5 节中详述的测定步骤以 384 孔板形式进行双报告基因测定，但使用移液机器人和自动磁性洗板器（材料表）处理样品。在384孔形式中，在1450rpm的孵育和洗涤期间摇动板，在测量荧光之前，在21°C和1800rpm下摇动板5分钟。