Un modello murino per la neovascolarizzazione corneale mediante ustione alcalina

Tutto il lavoro sugli animali, comprese le procedure sperimentali e l’eutanasia, è stato approvato dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Baylor College of Medicine con il numero di protocollo AN-8790. 1. Preparazione di 1 N NaOH Aggiungere 4 mL di acqua deionizzata sterile a una provetta da centrifuga da 15 mL. Pesare 400 mg di idrossido di sodio (NaOH) e aggiungerlo con cura alla provetta. Sciogliere l’NaOH mescolando lentamente la soluzione con una bacchetta di vetro. Portare il volume a 10 ml aggiungendo acqua deionizzata sterile alla provetta e mescolare di nuovo capovolgendo delicatamente la provetta su e giù. Chiudere bene il tappo e conservare la soluzione a temperatura ambiente. Preparare la soluzione fresca ogni mese perché la concentrazione della soluzione di NaOH può essere ridotta dall’assorbimento dell’anidride carbonica nell’aria. Mescolare sempre delicatamente la soluzione di NaOH prima dell’uso.ATTENZIONE: Preparare la soluzione all’interno di una cappa chimica e indossare adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI). 2. Preparazione della soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% Aggiungere 30 mL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in un bicchiere di vetro. Pesare 4 g di paraformaldeide (PFA) e aggiungerla al becher. Conservare il becher su una piastra calda a 60 °C mescolando. Aggiungere la soluzione di NaOH 1 N goccia a goccia per aumentare il pH fino a quando la soluzione non si schiarisce. Controllare e regolare il pH a 7,4 utilizzando 1 N di acido cloridrico (HCl). Regolare il volume finale a 50 mL con 1x PBS. Raffreddare e filtrare la soluzione. Conservare la soluzione a 4 °C.ATTENZIONE: Preparare la soluzione in una cappa aspirante indossando DPI adeguati. 3. Preparazione del cocktail ketamina/xilazina Preparare il cocktail ketamina/xilazina aggiungendo 0,8 mL di ketamina (concentrazione madre: 100 mg/mL) e 0,16 mL di xilazina (concentrazione madre: 100 mg/mL) a 9,4 mL di soluzione fisiologica. Conservare il cocktail in flaconi sterili per iniezione a temperatura ambiente (RT). 4. Ustione alcalina sulla cornea del topo Iniettare meloxicam (4-6 mg/kg di peso corporeo) per via sottocutanea 30 minuti prima della procedura per alleviare il dolore. Anestetizzare i topi (C57BL/6J, 6-8 settimane di età, maschio) utilizzando un’iniezione per via endovenosa del cocktail ketamina/xilazina (ketamina 80 mg/kg e xilazina 16 mg/kg di peso corporeo). Controllare la risposta riflessa (ritiro del pedale) pizzicando le dita del mouse e confermare l’assenza del riflesso. Applicare una goccia di anestetico topico, proparacaina allo 0,5%, sulla superficie corneale di un occhio e una goccia di lacrime artificiali sull’altro occhio. Utilizzando un punzone per biopsia da 2 mm, perforare i dischi di carta da filtro Whatman. Aggiungere 2 μL di NaOH 1N a una capsula di Petri pulita. Mettere il disco di carta da filtro da 2 mm sulla goccia di NaOH da 1 N e lasciarlo in ammollo per 15 s. Prendi la carta da filtro con una pinza e applica la carta da filtro sull’occhio trattato con proparacaina al centro della cornea per 30 secondi.NOTA: La carta da filtro deve toccare solo il centro della cornea e prestare attenzione per evitare il movimento della carta da filtro una volta posizionata, poiché lo spostamento della carta da filtro può causare ustioni ai tessuti adiacenti. Lavare l’occhio lavando con 20 ml di soluzione salina sterile in una siringa sterile.NOTA: È necessario prestare attenzione per garantire che la cornea, insieme al sacco congiuntivale, venga lavata accuratamente per garantire che non vengano danneggiati ulteriormente la cornea o il tessuto circostante. Il lavaggio del sacco congiuntivale previene ulteriormente il symblefaron. Pulisci delicatamente la soluzione salina in eccesso dagli occhi e dall’area circostante utilizzando salviette morbide usa e getta. Successivamente, tieni i topi in una gabbia di recupero su un termoforo caldo fino a quando non deambulano.NOTA: I topi vengono monitorati quotidianamente dopo l’ustione alcalina per 3 giorni. Se si osservano sintomi di dolore o stress, meloxicam (4-6 mg/kg di peso corporeo) viene somministrato per via sottocutanea. 5. Esame e valutazione della neovascolarizzazione e dell’opacità Nei topi anestetizzati esaminare gli occhi al microscopio di dissezione il giorno 10 dopo l’ustione e ottenere immagini utilizzando una telecamera collegata al cannocchiale di dissezione per valutare l’opacità e la neovascolarizzazione.NOTA: È sufficiente un normale endoscopio di dissezione con una telecamera collegata. Mentre osservi la cornea attraverso il microscopio di dissezione, valutare l’opacità dopo l’ustione in base alla seguente scala12:0 = Nessuna opacità; cornea chiara1 = Opacità lieve; leggera opacità nelle zone dell’iride e della pupilla; iride e pupilla facilmente visibili2 = Opacità moderata; iride e pupilla appena visibili3 = Opacità grave; Iride o pupilla non visibili4 = Cornea opaca; Iride e pupilla non visibili Mentre si osserva la cornea attraverso il microscopio da dissezione, valutare il CoNV in base alla seguente scala12:0 = Nessuna neovascolarizzazione; Nessun nuovo vascello dal limbus1 = Neovascolarizzazione lieve; nuove navi provenienti dal limbus2 = Neovascolarizzazione moderata; I vasi sanguigni hanno avuto origine dal limbus e si sono sviluppati verso il centro della cornea3 = Neovascolarizzazione grave; vasi sanguigni che originano dal limbus e che raggiungono e/o attraversano il centro della cornea Usa un test t di Student per confrontare statisticamente i punteggi di opacità e neovascolarizzazione tra i gruppi di ustioni alcaline e occhi sani. Sopprimere i topi il giorno 10 con esposizione all’isoflurano al 5% fino a 1 minuto dopo l’arresto della respirazione, seguito da lussazione cervicale, e raccogliere le cornee per l’imaging a montaggio piatto. 6. Tomografia a coerenza ottica (OCT) Acquisisci immagini OCT del segmento anteriore degli occhi nei topi anestetizzati il giorno 10 dopo l’ustione. Esegui l’acquisizione di immagini OCT come scansione volumetrica utilizzando la modalità IR + OCT con un campo visivo di 30° e un’intensità IR del 100%. Quantificare lo spessore delle cornee utilizzando il software ImageJ. Per misurare lo spessore, utilizzare lo strumento Selezione linea nel software ImageJ per creare una linea retta tra le superfici anteriore e posteriore in corrispondenza della cornea centrale. Fare clic su Analizza > Misura negli strumenti software per trasferire i valori nella finestra dei dati. Copiare i valori in un foglio di calcolo e confrontare statisticamente lo spessore corneale tra l’ustione alcalina e i gruppi oculari sani utilizzando un test t di Student.NOTA: Lo spessore della cornea è la distanza da un punto sulla superficie corneale anteriore al punto più vicino sulla superficie corneale posteriore al centro corneale. 7. Immunocolorazione per CoNV su cornee flat-mount Sopprimere i topi il giorno 10 dopo l’ustione alcalina ed enucleare gli occhi con una dissezione contundente. Separa le palpebre usando il pollice e l’indice e posiziona una pinza sotto il globo oculare. Chiudi la pinza ed estrai delicatamente il bulbo oculare dall’orbita. Posiziona i bulbi oculari in 1x PBS. Per ogni bulbo oculare, rimuovere la cornea dal globo oculare praticando prima un’incisione con un ago da 30 G sotto l’area del limbus. Taglia intorno all’area del limbus usando le microforbici corneali, con l’incisione come punto di partenza, e separa lentamente la cornea e il limbus dal globo. Pulisci delicatamente le cornee con un pennello fine per rimuovere l’iride. Fissare le cornee in paraformaldeide al 4% per 1 ora. Lavare le cornee tre volte per 20 minuti ciascuna in 1x PBS a temperatura ambiente (RT). Incubare in un tampone bloccante (1x PBS integrato con lo 0,1% di Triton-X 100 e il 5% di albumina sierica bovina [BSA]) per 1 ora a RT. Trasferire le cornee in una soluzione anticorpale contenente anticorpi primari. Preparare la soluzione anticorpale in 1x PBS integrato con 1% di BSA, 0,1% Triton-X 100, anticorpi monoclonali anti-CD31 coniugati Dylight550 (1:100) e anticorpi monoclonali anti-LYVE-1 coniugati con Alexa Fluor488 (1:100). Incubare per 3 giorni a 4 °C. Lavare le cornee in PBS 1x tre volte per 20 minuti ciascuna. Colorare i nuclei con la soluzione colorante Hoechst (1:1.000) per 5 minuti al buio. Appiattire le cornee con tagli radiali e montarle su un vetrino pre-pulito utilizzando il mezzo di montaggio e i vetrini coprioggetti. Sigillare i vetrini coprioggetti con smalto trasparente e asciugare i vetrini per una notte al buio prima dell’analisi al microscopio confocale. Visualizzare le cornee piatte utilizzando la microscopia confocale cucendo le singole immagini Z-stack; Utilizzare un obiettivo 10x, laser da 488 nm e 561 nm e una risoluzione di 512 pixel x 512 pixel per fetta su scanner Galvano non risonanti. Quantifica la densità del sangue CD31+ e dei vasi linfatici LYVE-1+ utilizzando il software ImageJ. Per determinare la densità vascolare, convertire le immagini confocali in un’immagine a 8 bit. Scegli Densità vascolare dai plugin. Scegli la regione di interesse sull’immagine e fai clic su OK. Le misurazioni si apriranno in una nuova finestra di dati. Copiare i valori in un foglio di calcolo e confrontare statisticamente la densità vascolare tra l’ustione alcalina e i gruppi oculari sani utilizzando un test t di Student.NOTA: CD31, chiamato anche molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche-1 (PECAM-1), è una molecola di adesione cellulare coinvolta nell’angiogenesi ed è altamente espressa nelle cellule endoteliali dei vasi sanguigni precoci e maturi13. LYVE-1 (lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1) è un marcatore di superficie cellulare sulle cellule endoteliali linfatiche e può essere utilizzato come marcatore di linfangiogenesi14.