Ein Mausmodell für Hornhautneovaskularisation durch Alkaliverbrennung

Alle tierischen Arbeiten, einschließlich der Versuchsverfahren und der Euthanasie, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Baylor College of Medicine mit der Protokollnummer AN-8790 genehmigt. 1. Herstellung von 1 N NaOH Geben Sie 4 ml steriles deionisiertes Wasser in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. 400 mg Natriumhydroxid (NaOH) abwiegen und vorsichtig in das Röhrchen geben. Lösen Sie die NaOH auf, indem Sie die Lösung langsam mit einem Glasstab umrühren. Füllen Sie das Volumen auf 10 ml, indem Sie steriles deionisiertes Wasser in das Röhrchen geben, und mischen Sie es erneut, indem Sie das Röhrchen vorsichtig auf und ab drehen. Verschließen Sie die Kappe fest und lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die frische Lösung jeden Monat zu, da die Konzentration der NaOH-Lösung dadurch verringert werden kann, dass die Lösung Kohlendioxid in der Luft absorbiert. Mischen Sie die NaOH-Lösung vor Gebrauch immer vorsichtig.VORSICHT: Bereiten Sie die Lösung in einer chemischen Haube vor und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA). 2. Herstellung der 4%igen Paraformaldehyd (PFA)-Lösung 30 ml 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in ein Glasbecherglas geben. 4 g Paraformaldehyd (PFA) abwiegen und in das Becherglas geben. Den Becher auf einer heißen Platte bei 60 °C unter Rühren aufbewahren. Geben Sie die 1 N NaOH-Lösung tropfenweise hinzu, um den pH-Wert zu erhöhen, bis die Lösung klar ist. Prüfen und stellen Sie den pH-Wert mit 1 N Salzsäure (HCl) auf 7,4 ein. Stellen Sie das Endvolumen mit 1x PBS auf 50 ml ein. Kühlen Sie die Lösung ab und filtern Sie sie. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C.VORSICHT: Bereiten Sie die Lösung in einem Abzug zu, während Sie geeignete PSA tragen. 3. Zubereitung des Ketamin/Xylazin-Cocktails Bereiten Sie den Ketamin/Xylazin-Cocktail zu, indem Sie 0,8 ml Ketamin (Stammkonzentration: 100 mg/ml) und 0,16 ml Xylazin (Stammkonzentration: 100 mg/ml) zu 9,4 ml Kochsalzlösung hinzufügen. Bewahren Sie den Cocktail in sterilen Injektionsflaschen bei Raumtemperatur (RT) auf. 4. Alkalibrand auf der Hornhaut der Maus Meloxicam (4-6 mg/kg Körpergewicht) 30 Minuten vor dem Eingriff zur Schmerzlinderung subkutan injizieren. Betäubung der Mäuse (C57BL/6J, 6-8 Wochen alt, männlich) mit einer i.p. Injektion des Ketamin/Xylazin-Cocktails (Ketamin 80 mg/kg und Xylazin 16 mg/kg Körpergewicht). Überprüfen Sie die Reflexreaktion (Pedalrückzug), indem Sie die Zehen der Maus zusammendrücken, und bestätigen Sie, dass der Reflex nicht vorhanden ist. Tragen Sie einen Tropfen topisches Anästhetikum, 0,5% Proparacain, auf die Hornhautoberfläche eines Auges und einen Tropfen künstliche Tränen auf das andere Auge auf. Stanzen Sie mit einer 2-mm-Biopsiestanze Whatman-Filterpapierscheiben aus. 2 μl 1N NaOH in eine saubere Petrischale geben. Die 2-mm-Filterpapierscheibe auf den 1 N NaOH-Tropfen legen und 15 s einwirken lassen. Nehmen Sie das Filterpapier mit einer Pinzette auf und tragen Sie das Filterpapier 30 s lang auf das mit Proparacain behandelte Auge in der Mitte der Hornhaut auf.HINWEIS: Das Filterpapier darf nur die Mitte der Hornhaut berühren, und es muss darauf geachtet werden, dass sich das Filterpapier nach dem Einsetzen nicht bewegt, da das Bewegen des Filterpapiers zu Verbrennungen der angrenzenden Gewebe führen kann. Waschen Sie das Auge, indem Sie es mit 20 ml steriler Kochsalzlösung in einer sterilen Spritze spülen.HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, dass die Hornhaut zusammen mit dem Bindehautsack gründlich gewaschen wird, um sicherzustellen, dass die Hornhaut oder das umgebende Gewebe nicht weiter beschädigt werden. Das Waschen des Bindehautsacks beugt dem Symblepharon weiter vor. Wischen Sie die überschüssige Kochsalzlösung vorsichtig mit weichen Einwegtüchern von den Augen und der Umgebung ab. Halten Sie die Mäuse anschließend in einem Erholungskäfig auf einem warmen Heizkissen, bis sie gehfähig sind.HINWEIS: Mäuse werden nach der Alkaliverbrennung 3 Tage lang täglich überwacht. Bei Schmerz- oder Stresssymptomen wird Meloxicam (4-6 mg/kg Körpergewicht) subkutan verabreicht. 5. Untersuchung und Beurteilung der Neovaskularisation und Trübung Bei anästhesierten Mäusen werden die Augen am 10. Tag nach der Verbrennung unter einem Seziermikroskop untersucht und Bilder mit einer am Seziergerät befestigten Kamera aufgenommen, um die Trübung und Neovaskularisation zu bewerten.HINWEIS: Ein normales Sezierfernrohr mit angeschlossener Kamera ist ausreichend. Während Sie die Hornhaut durch das Präpariermikroskop betrachten, bewerten Sie die Trübung nach der Verbrennung anhand der folgenden Skala12:0 = Keine Deckkraft; Klare Hornhaut1 = Leichte Deckkraft; leichte Trübung im Iris- und Pupillenbereich; Iris und Pupille gut sichtbar2 = Mäßige Deckkraft; Iris und Pupille kaum sichtbar3 = Starke Deckkraft; Iris oder Pupille nicht sichtbar4 = Undurchsichtige Hornhaut; Iris und Pupille nicht sichtbar Während Sie die Hornhaut durch das Präpariermikroskop betrachten, bewerten Sie die CoNV anhand der folgenden Skala12:0 = Keine Neovaskularisation; Keine neuen Gefäße aus dem Limbus1 = Leichte Neovaskularisation; Neue Gefäße, die aus dem Limbus stammen2 = Moderate Neovaskularisation; Die Blutgefäße entsprangen dem Limbus und wuchsen zum Zentrum der Hornhaut hin3 = Schwere Neovaskularisation; Blutgefäße, die vom Limbus ausgehen und das Zentrum der Hornhaut erreichen und/oder kreuzen Verwenden Sie einen Student’s t-Test, um die Trübungs- und Neovaskularisierungswerte zwischen der Alkaliverbrennungs- und der gesunden Augengruppe statistisch zu vergleichen. Euthanasieren Sie die Mäuse an Tag 10 durch Isofluran-Exposition bei 5% bis 1 Minute nach Atemstopps, gefolgt von einer Zervixluxation, und sammeln Sie die Hornhäute für die flache Bildgebung. 6. Optische Kohärenztomographie (OCT) Nehmen Sie OCT-Bilder des vorderen Augenabschnitts bei anästhesierten Mäusen am 10. Tag nach der Verbrennung an. Führen Sie die OCT-Bildaufnahme als Volumenscan im IR + OCT-Modus mit einem Sichtfeld von 30° und einer IR-Intensität von 100 % durch. Quantifizieren Sie die Dicke der Hornhäute mit der ImageJ-Software. Um die Dicke zu messen, verwenden Sie das Linienauswahl-Werkzeug in der ImageJ-Software, um eine gerade Linie zwischen der vorderen und der hinteren Fläche an der zentralen Hornhaut zu erstellen. Klicken Sie in den Software-Tools auf Analyze > Measure , um die Werte in das Datenfenster zu übertragen. Kopieren Sie die Werte in eine Tabellenkalkulationsdatei, und vergleichen Sie statistisch die Hornhautdicke zwischen der Alkaliverbrennungs- und der gesunden Augengruppe mit einem Schüler-t-Test.HINWEIS: Die Dicke der Hornhaut ist der Abstand von einem Punkt auf der vorderen Hornhautoberfläche zum nächstgelegenen Punkt auf der hinteren Hornhautoberfläche in der Hornhautmitte. 7. Immunfärbung für CoNV auf flach montierten Hornhäuten Euthanasieren Sie die Mäuse am 10. Tag nach der Alkaliverbrennung und enukleieren Sie die Augen durch stumpfe Sektion. Ziehen Sie die Augenlider mit Daumen und Zeigefinger auseinander und legen Sie eine Pinzette unter die Augenkugel. Schließen Sie die Pinzette und ziehen Sie den Augapfel vorsichtig von der Augenhöhle ab. Legen Sie die Augäpfel in 1x PBS. Entfernen Sie für jeden Augapfel die Hornhaut aus der Augenkugel, indem Sie zunächst einen Schnitt mit einer 30-G-Nadel unterhalb des Limbusbereichs machen. Schneiden Sie mit einer Hornhaut-Mikroschere um den Limbusbereich herum, mit dem Einschnitt als Ausgangspunkt, und trennen Sie langsam die Hornhaut und den Limbus von der Kugel. Reinigen Sie die Hornhaut vorsichtig mit einem feinen Pinsel, um die Iris zu entfernen. Fixieren Sie die Hornhäute 1 h lang in 4%igem Paraformaldehyd. Waschen Sie die Hornhäute dreimal für jeweils 20 min in 1x PBS bei Raumtemperatur (RT). In einem Blockierungspuffer (1x PBS supplementiert mit 0,1% Triton-X 100 und 5% Rinderserumalbumin [BSA]) für 1 h bei RT inkubieren. Übertragen Sie die Hornhäute in eine Antikörperlösung, die primäre Antikörper enthält. Bereiten Sie die Antikörperlösung in 1x PBS mit 1 % BSA, 0,1 % Triton-X 100, Dylight550-konjugiertem Anti-CD31-mAb (1:100) und Alexa Fluor488-konjugiertem Anti-LYVE-1-mAb (1:100) vor. 3 Tage bei 4 °C inkubieren. Waschen Sie die Hornhäute in 1x PBS dreimal für jeweils 20 min. Die Zellkerne mit Hoechst-Färbelösung (1:1.000) 5 min im Dunkeln färben. Glätten Sie die Hornhäute mit radialen Schnitten und montieren Sie sie mit Eindeckmaterial und Deckgläsern auf einem vorgereinigten Objektträger. Versiegeln Sie die Deckgläser mit klarem Nagellack und trocknen Sie die Objektträger über Nacht im Dunkeln, bevor Sie sie mit konfokaler Mikroskopie analysieren. Abbildung der flach montierten Hornhäute mit konfokaler Mikroskopie durch Zusammenfügen einzelner Z-Stapel-Bilder; Verwenden Sie ein 10-fach-Objektiv, 488-nm- und 561-nm-Laser und eine Auflösung von 512 x 512 Pixeln pro Schicht auf nicht-resonanten Galvano-Scannern. Quantifizierung der Dichte von CD31+-Blut- und LYVE-1+-Lymphgefäßen mit der ImageJ-Software. Um die Gefäßdichte zu bestimmen, wandeln Sie die konfokalen Bilder in ein 8-Bit-Bild um. Wählen Sie Vascular Density aus den Plugins. Wählen Sie die gewünschte Region auf dem Bild aus und klicken Sie auf OK. Die Messungen werden in einem neuen Datenfenster geöffnet. Kopieren Sie die Werte in eine Tabellenkalkulationsdatei, und vergleichen Sie statistisch die Gefäßdichte zwischen der Alkaliverbrennungs- und der gesunden Augengruppe mit einem Schüler-t-Test.HINWEIS: CD31, auch Thrombozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekül-1 (PECAM-1) genannt, ist ein Zelladhäsionsmolekül, das an der Angiogenese beteiligt ist und in den Endothelzellen früher und reifer Blutgefäße stark exprimiert wird13. LYVE-1 (lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1) ist ein Zelloberflächenmarker auf lymphatischen Endothelzellen und kann als Lymphangiogenese-Marker verwendet werden14.