拟南芥的高分辨率、单粒、体内花粉水合生物测定

1.植物生长和花的准备 在4°C下将0.1%琼脂糖或无菌水分层A . thaliana 种子3天，或在-20°C下作为干燥种子16-24小时（uNASC，个人通信）。 将分层的种子转移到堆肥盆中，并放置在环境控制的生长室中。用荧光灯管（130μmolm-2 s-1）提供的16：8小时，光：暗光周期繁殖植物。将温度保持在21±2°C，相对湿度约为40%。 确保花粉供体和受体植物以及任何其他适当的“对照”植物系一起播种，以确保同步开花。将植物繁殖约6周，直到花序完全建立。 在进行阉割16，17的生物测定前1天在花粉受体植物上选择阶段12花蕾-这些是未开放的花蕾，将在第二天完成开花和花药裂开18。注意：避免在主花序上产生的前三朵花，因为这些花通常表现出不寻常的繁殖行为。如果可用且适合研究，请使用雄性不育植物系，例如拟 南芥 （加入Col-0）pA9-barnase系，其中花药无法成熟19。 要阉割花粉接受者的花朵，请将植物侧放在花盆中。将植物茎在靠近将被阉割的花朵的区域粘在在立体解剖显微镜下就位的载玻片上。 使用一对细尖镊子，小心地挑开花蕾，去除所有花瓣和花药。确保雌蕊未损坏，柱头没有污染花粉。注意：雄性不育植物系不需要阉割。 将植物放回生长室，确保阉割的花朵不会与其他植物或异物接触。 2. 花粉水合测定-原始数据采集 第二天早上，从生长室中取出植物。将花粉受体植物侧放，并将花放在倒置显微镜的载物台上（图2），以便可以清楚地对柱头进行成像。 通过使用遮蔽胶带将茎固定在载玻片上来固定要成像的花的位置。保持温度在18°C至25°C之间，相对湿度在60%以下。注意：对于pA9-barnase雄性不育植物系，最好在早晨花朵开放且花瓣不妨碍视野时进行测定。 接下来，从花粉供体植物中取出一朵健康且刚开放的花。置于解剖显微镜下，轻轻触摸花药，在干净的细尖镊子的尖端收集一些花粉粒（图3A）。贴在短杆上的睫毛也是收集和转移花粉的有效工具（图3C）。 通过轻轻触摸从收获花粉粒的花瓣上来去除镊子中多余的花粉，直到在镊子的尖端形成单层花粉粒。注意：细尖镊子尖端的单层花粉粒将显着促进后续步骤中的单粒转移。通过这种技术也可以在镊子上获得一个花粉粒（补充视频S1）。 返回花粉受体植物，并使用低倍物镜（例如，10倍物镜; 图3B），将倒置显微镜聚焦在要授粉的柱头上。 沿着镊子臂之间的开口握住镊子（图4），小心地接近未授粉（“处女”）柱头细胞。注意：我们发现这种握住镊子的方法有助于灵活性并减少握手的影响。显微操纵器可用于经验不足或难以手动精确施用单个花粉粒的用户。 在镊子上选择适当位置的花粉粒以转移到柱头上。继续接近未授粉的柱头细胞，直到选定的花粉粒与其表面轻接触。慢慢抽出镊子并确认花粉附着（图5）。注意：补充视频 S1 和补充视频 S2 演示了这一步骤，镊子上同时存在单个和多个花粉粒。 确保花粉粒的方向使其赤道轴清晰可见且聚焦清晰。立即切换到更高倍率的物镜（例如，20x）并捕获花粉粒的图像。第一个图像是 T = 0。继续以 1 分钟的间隔捕获更多图像，总共 10 分钟。 根据需要调整焦点，以适应花粉粒或柱头的微小移动。每2分钟记录一次房间的环境温度和相对湿度，以便将来在实验重复之间进行比较。 捕获所有图像后，将它们保存为无损格式，例如制造商的专有格式或TIFF。注意：每个花粉粒采样将有11个图像（补充图S1）。大多数专有图像采集软件中的自动/手动延时采集设置是便于组织每个时间序列的有用功能。 对其他花粉粒重复步骤2.4至2.9。获取几乎相等数量的对照（野生型 [WT]）和实验授粉的数据。 图2：用于花粉水合生物测定的设备设置。 在本例中，pA9-barnase雄性不育植物系是花粉受体。将植物放在花盆内，侧放，茎贴在显微镜载物台上的载玻片上。为了减少机械应力并帮助植物定位，使用可调节的平台来支撑花盆。 请点击此处查看此图的大图。 图3：从花粉供体花中收集花粉粒。 图像显示了（A）细尖镊子和（C）睫毛的使用。花粉团（红色箭头）应通过轻轻触摸供体花的花瓣来去除，直到获得单层花粉粒（绿色箭头）。（B）未授粉的拟 南芥 （Col-0）pA9-barnase雄性无菌系柱头的高分辨率图像，该柱头已达到花粉水合生物测定的适当发育阶段。比例尺 = 100 μm （B）。 请点击此处查看此图的大图。 图4：将花粉转移到受体柱头时握住镊子的方法。 （A）握住镊子的方向不正确;（二）握住镊子的正确方向。在这种配置中侧向握住镊子，如拇指在镊子臂之间的位置所示，可提供更大的稳定性，以促进花粉粒转移到未授粉的柱头上。 请点击此处查看此图的大图。 图5：将单个花粉粒从一对镊子的尖端转移到pA9-barnase雄性不育植物的未授粉（“处女”）柱头细胞。 （A）小心接近细胞。（B）将适当定位的花粉粒（蓝色箭头）附着在细胞（橙色箭头）上。（C）抽出镊子和目视确认花粉附着（紫色箭头）。面板A-C使用10倍物镜（10.5毫米工作距离;0.25数值孔径）成像，并且是从补充视频S1中呈现的视频剪辑中获得的快照。（D）过渡到20倍物镜（2.1毫米工作距离;0.5数值孔径），以启动时间序列中的图像捕获。请点击此处查看此图的大图。 3. 花粉水合测定-测量 将花粉水合速率定义为花粉粒（即赤道半径）的半短轴（图6）长度随时间的变化，并将其表示为百分比变化（等式[1]）： （1） 使用图像分析软件，记录实验系列中每个花粉粒的半短轴值。注意：此测量选项的名称取决于软件，例如“旋转椭圆”或“5点椭圆”。 对要测量的所有其他花粉粒重复步骤3.1-3.2。为了保持一致性，请应用相同程度的数字变焦和相同的方法来定义数据集中 所有 测量值的“花粉边界”。 完成时间序列的所有测量后，将每个图像堆栈的原始半短轴值导出到电子表格，并以每个图像堆栈的列形式显示数据。确保在每个植物品系的分析中包括至少15个水合花粉粒的数据（补充表S1）。 少量花粉粒未能水合或水合速度明显慢于预期的情况并不罕见。这些“哑弹”颗粒可能是谷物与细胞接触不良的结果，或与花粉活力有关。从数据集中查找并排除这些，除非在实验设计中需要这些。 计算每条植物线每个时间点的平均值。使用非配对 t 检验和单因子方差分析对每个时间点 WT 和突变线的水合数据进行统计分析。使用多重 t 检验同时比较多个时间点的 WT 和突变线之间的均值。注意：XY图对于可视化所比较的植物系之间花粉水合的总体趋势也非常有用。 图 6：南 芥 柱柱状细胞上的 WT 花粉粒水合（Col-0; pA9-barnase 雄性不育系）。 （A） 时间点零点、0 （0 MAP） 和 （B） 10 MAP。花粉粒周围的红色圆圈是操作员使用图像分析软件定义和绘制的“花粉边界”。花粉内的绿色和深红色线分别代表半长轴和半短轴。半短轴的长度用于计算花粉的水合作用程度。该数据集的完整时间序列可在 补充图S1中找到。图像是用20倍物镜（工作距离2.1毫米;0.5数值孔径）拍摄的。比例尺 = 50 μm。缩写：MAP = 授粉后最小值。 请点击此处查看此图的大图。