シロイヌナズナの高分解能単粒in in vivo花粉水和バイオアッセイ

1.植物の成長と花の準備 A. thaliana種子を0.1%アガロースまたは滅菌水で4°Cで3日間、または乾燥種子として-20°Cで16〜24時間層別化します(uNASC、パーソナルコミュニケーション)。 成層した種子を堆肥の鉢に移し、環境的に制御された成長チャンバーに入れます。蛍光管(130 μmol m-2 s-1)によって提供される16:8時間の明:暗光周期で植物を繁殖させます。温度を21±2°C、相対湿度約40%に維持します。 花粉供与者とレシピエントの植物は、他の適切な「防除」植物系統とともに一緒に播種され、同期開花を確実にします。花序が十分に確立されるまで、約6週間植物を繁殖させます。 去勢のためのバイオアッセイを実施する1日前に花粉レシピエント植物でステージ12の花芽を選択する16,17-これらは、翌日に開花と葯裂開を完了する未開封の花芽です18。注:主花序で生成される最初の3つの花は、通常、異常な繁殖行動を示すため、避けてください。利用可能で研究に適した場合は、葯が成熟しない A.タリアナ (アクセッションCol-0)pA9-バルナーゼラインなどの雄の無菌植物系統を使用してください19。 花粉レシピエントの花を去勢するには、植物を鉢に入れて横に置きます。去勢される花に近い領域で、実体解剖顕微鏡の下で所定の位置にあるスライドガラスに植物の茎をテープで留めます。 先端の細かい鉗子を使用して、花芽を慎重に開き、花びらと葯をすべて取り除きます。雌しべに損傷がなく、柱頭に汚染された花粉がないことを確認してください。注:雄の無菌植物系統は去勢を必要としません。 植物を成長室に戻し、去勢された花が他の植物や異物と接触しないようにします。 2. 花粉水和アッセイ-生データ取得 翌朝、成長室から植物を取り除きます。花粉受容植物を横向きに置き、柱頭をはっきりと画像化できるように、倒立顕微鏡のステージ(図2)に花を置きます。 マスキングテープのストリップを使用して茎をスライドガラスに固定することにより、画像化する花の位置を固定します。温度を18°C〜25°C、相対湿度を60%未満に維持します。注:pA9-バルナーゼ雄性無菌植物系統の場合、花が開き、花びらが視野を妨げない朝にアッセイを実行するのが最適です。 次に、花粉供与体植物から健康で開いたばかりの花を取り除きます。解剖顕微鏡の下に置き、葯にそっと触れて、きれいな細い先端の鉗子の先端にいくつかの花粉粒を集めます(図3A)。短い棒にテープで留められたまつげも、花粉を集めて移動するための効果的なツールです(図3C)。 鉗子の先端に花粉粒の単層が形成されるまで、花粉粒が収穫された花の花弁に軽く触れて、鉗子から余分な花粉を取り除きます。注意: 先端の細かい鉗子の先端にある花粉粒の単層は、後続のステップでの単一穀物の移動を大幅に促進します。また、この手法により鉗子上に1粒の花粉粒を得ることも可能である(補足映像S1)。 花粉受容植物に戻り、低倍率対物レンズ(例えば、10倍対物レンズ; 図3B)、受粉する柱頭に倒立顕微鏡を集中させる。 鉗子の腕の間の開口部に沿って鉗子を持ち(図4)、受粉していない(「処女」)柱頭乳頭細胞に注意深く近づきます。注:鉗子を保持するこの方法は、器用さを助け、握手の影響を軽減することがわかりました。マイクロマニピュレーターは、経験の浅いユーザーや、単一の花粉粒を手で正確に塗布するのが難しいユーザーに使用できます。 柱頭に移すために鉗子に適切に配置された花粉粒を選択してください。選択した花粉粒がその表面に軽く接触するまで、受粉していない柱頭乳頭細胞に近づき続けます。鉗子をゆっくりと引き出し、花粉の付着を確認します(図5)。注:補足ビデオS1と補足ビデオS2は、鉗子に単一および複数の花粉粒が存在する状態でこのステップを示しています。 花粉粒が赤道軸がはっきりと見え、焦点が合うように向けられていることを確認してください。すぐに高倍率の対物レンズ(20倍など)に切り替えて、花粉粒の画像をキャプチャします。この第1の画像はT=0である。さらに 1 分間隔で合計 10 分間の画像をキャプチャし続けます。 必要に応じてフォーカスを調整して、花粉粒または柱頭の小さな動きに対応します。部屋の周囲温度と相対湿度を2分ごとに記録して、実験反復間の将来の比較を可能にします。 すべての画像がキャプチャされたら、メーカー独自の形式やTIFFなどのロスレス形式で保存します。注:サンプリングされた花粉粒ごとに11枚の画像があります(補足図S1)。ほとんどの独自の画像取得ソフトウェアの自動/手動タイムラプス取得設定は、各時系列の整理を容易にする便利な機能です。 追加の花粉粒について、手順2.4〜2.9を繰り返します。ほぼ同数のコントロール(野生型[WT])と実験的受粉のデータを取得します。 図2:花粉水和バイオアッセイに利用される装置のセットアップ。 この例では、pA9-バルナーゼ雄性無菌植物系統が花粉受容者であった。植物を鉢の中に横向きに置き、茎を顕微鏡のステージに配置されたスライドガラスにテープで留めました。機械的ストレスを軽減し、植物の位置決めを支援するために、植木鉢を支えるために調整可能なプラットフォームが使用されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:花粉供与体の花からの花粉粒の採取。 画像は、(A)先端の細かい鉗子と(C)まつげの使用を示しています。花粉の塊(赤い矢印)は、花粉粒の単層が得られるまで、ドナーの花の花弁に軽く触れて取り除く必要があります(緑の矢印)。(B)花粉水和バイオアッセイに適した発達段階に達した、受粉していない A.タリアナ (Col-0)pA9-バルナーゼ雄の無菌系統の柱頭の高解像度画像。スケールバー = 100 μm (B)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:花粉をレシピエントスティグマに移す際の鉗子の保持方法 。 (A)鉗子を保持するための誤った向き。(B)鉗子を保持するための正しい向き。この構成で鉗子を横に保持すると、鉗子の腕の間の親指の位置によって示されるように、受粉していない柱頭乳頭への花粉粒の移動を容易にするための安定性が向上します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:pA9-バルナーゼ雄性無菌植物の受粉していない(「処女」)柱頭細胞への一対の鉗子の先端からの単一の花粉粒の移動 。 (A)乳頭細胞への慎重なアプローチ。(B)適切な位置の花粉粒(青い矢印)の乳頭細胞への付着(オレンジ色の矢印)。(C)鉗子の引き抜きと花粉の付着の目視確認(紫色矢印)。パネル A〜C は、10倍の対物レンズ(10.5 mmの作動距離、0.25の開口数)で撮影され、 補足ビデオS1で提示されたビデオクリップから得られたスナップショットです。(D)20倍の対物レンズ(作動距離2.1mm、開口0.5)に移行し、時系列での画像キャプチャを開始します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 3. 花粉水和アッセイ測定 花粉の水和速度を、花粉粒の半短軸(図6)の長さ(赤道半径)の経時変化として定義し、変化率として表します(式[1])。 (1) 画像解析ソフトを用いて、実験系列の各花粉粒の半短軸値を記録します。注意: この測定オプションの名前は、「回転楕円」や「5点楕円」などのソフトウェアによって異なります。 測定する他のすべての花粉粒について、手順3.1〜3.2を繰り返します。一貫性を保つために、同じ程度のデジタルズームと同じアプローチを適用して、データセット 内のすべての 測定値に「花粉境界」を定義します。 時系列のすべての測定が完了したら、各画像スタックの生の半短軸の値をスプレッドシートにエクスポートし、画像スタックごとの列にデータを表示します。各植物系統の分析に少なくとも15の水和花粉粒からのデータが含まれていることを確認してください(補足表S1)。 少数の花粉粒が水和に失敗したり、予想よりも大幅にゆっくりと水和したりすることは珍しくありません。これらの「不発」穀物は、穀物と乳頭細胞の間の不十分な接触の結果であるか、花粉の生存率に関連している可能性があります。実験計画で必要でない限り、これらを探してデータセットから除外します。 プラントラインごとの各時点の平均値を計算します。対応のない t検定と一元配置分散分析を使用して、各時点でのWTおよび変異株からの水分補給データの統計分析を行います。 複数のt検定を使用して、複数の時点にわたるWT系統と変異株の平均を同時に比較します。注:XYプロットは、比較される植物系統間の花粉水和の全体的な傾向を視覚化するのにも非常に役立ちます。 図6: A.タリアナ の柱頭乳頭細胞で水和するWT花粉粒(Col-0;pA9-バルナーゼ雄性無菌系統)。 (A)時点0、0(0マップ)および(B)10マップ。花粉粒の周りの赤い円は、オペレーターが画像解析ソフトを使って定義・描いた「花粉境界」です。花粉の内側の緑と濃い赤の線は、それぞれ半長軸と半短軸を表しています。半短軸の長さは、花粉の水和の程度を計算するために使用されます。このデータセットの完全な時系列は、 補足図S1にあります。画像は20倍の対物レンズ(作動距離2.1 mm、絞り数0.5)で撮影しました。スケールバー = 50 μm。略語:MAP =最小受粉後。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。