用于荧光和共聚焦成像的玉米叶原基横向切片和展开整片的制备方法的改进方法

1. 玉米叶片发育阶段及实验设计 种植植物和分期叶子发育确定用于实验的植物的年龄和发育阶段，并对叶子发育进行详细的分期。注意：建议在与实验中使用的突变或转基因系具有相同遗传背景的植物上进行分期。SAM停止产生20到25 DAG之间的新叶，具体取决于遗传背景和生长条件。因此，此处描述的方法非常适合7-14 DAG的玉米幼苗。 按照合适的植物护理方案在温室或生长室中种植玉米植物35. 用小刀或一把剪刀在中胚叶（土壤表面下的茎）上切割，收集所需年龄或V期的植物（图1A）。小心地将切割工具插入幼苗旁边的土壤中，然后将其以 45° 角向下滑动到基部以切割中胚叶。 将幼苗从土壤中取出，并除尘可能附着在植物上的任何残留污垢或土壤颗粒。用手取下胚鞘，即覆盖幼苗新芽的保护鞘。 对于每株植物，记录V阶段，叶子的数量以及从螺旋中出现的最后一片叶子的长度。拍摄植物的照片以备将来参考。 逐个去除较旧的叶子。为此，用中胚叶或茎的残余物握住植物，并从鞘的底部切除每片叶子，并用牙科探针以盘旋的方式轻轻展开鞘（图1B）。注意：有关去除周围叶子的快速方法，请参阅步骤 2.1。 在放大倍率约为2倍的体视显微镜下，在湿巾上仔细解剖其余的芽尖，以防止样品变干。用弯曲的针或一对细镊子用牙科探针轻轻切除并展开每个叶原基，直到可以看到SAM，P1和P2（图1D）。记录每个质体的外观和尺寸。注：参见 补充文件1中玉米幼苗叶片发育分期的示例。 规划实验注意：仔细规划实验可以提高效率。例如，在横截面分析中，在对特定质体或区域成像时确定要切割的大致位置可以减少解剖时间。 图 2 显示了标准化采样的示例。此外，根据FP或荧光探针的特性优化成像参数可以提高实验效率。利用分期信息作为指导，将实验集中在特定的质体、原基区域和组织上。使用FP或其他感兴趣的荧光探针对一些样品进行以下第2和/或3节的跟踪。注：见 https://www.maizegdb.org/data_center/stock 处可用的玉米FP标记线36-42种子库存。 确定每个FP报告器或探头的最佳图像采集参数，包括适当的检测器或滤光片、激发和发射波长、针孔尺寸和其他设置。保存设置以重现每个实验的工作条件。注意：参见Linh和Scarpella30 ，了解发育中的叶子共聚焦激光扫描显微镜的一些技术指南。 根据FP报告器的半衰期和其他特性规划成像时间43。注意：在计划实验时，还必须考虑解剖和成像之间的时间，因为在此期间新鲜的植物样品会经历干燥和细胞变化。 图2：玉米叶原初横截面分析的采样方案。 （A，左）7 DAG玉米幼苗的近端芽，在P7处显示暴露的第四叶（L4）。虚线表示沿原基的七个采样点，从0.5毫米到10毫米。 （A，右）叶原基的示意图，以及每个质体的投影大小和位置：P7（白色）;P6（洋红色）;P5（蓝色）;P4（绿色）;和 P3 直到 SAM（黄色）。（波黑）横向切片的荧光图像，表示A中显示的采样点，从10毫米（B）到0.5毫米（高）。原基根据（A）中的质体配色方案进行假着色。使用长波通发射紫外滤光片对切片进行成像，以进行自发荧光。比例尺 = 200 μm （B-H）。该图经Robil和McSteen24许可修改和复制。缩写：DAG = 发芽后几天;P = 塑体;SAM = 枝顶端分生组织;† = 叶鞘或前鞘;* = 枝顶端分生组织;** = 茎。请点击此处查看此图的大图。 2. 玉米叶原基横断面成像 剥去周围较老的叶子并测量叶原基如步骤1.1.3-1.1.4（图1A）所述，用小刀或一把剪刀在土壤表面下方的中胚叶处小心地切割幼苗，以收集幼苗。 确定要使用的正确剥线钳孔尺寸以及沿拍摄进行切割的位置。确保孔足够大以适合目标原基。 从芽的较远端开始切割，并逐渐向基部工作，直到原基的尖端暴露出来。 要进行切割，请握住剥线钳，钳口朝向拍摄。将芽定位到选定的孔上，然后将剥离器手柄挤压在一起以切开叶涡。注意： 为避免意外切割目标原基，请小心地将芽的中心与剥线钳上的孔对齐。对于较大的植物，建议在使用剥离器之前手动去除周围的一些叶子。注意：剥线钳有锋利的钳口，如果不小心使用，可能会导致割伤或其他伤害。 在继续将手柄挤压在一起的同时，将剥离器从芽上滑开以修剪叶子的上部。确保原基中的目标区域仍然被周围的叶子包裹（补充图S1C，D）。注意：修剪上部叶子后，芽留下一个暴露的原基尖端（P5、P6 或 P7，具体取决于切割的位置和所用剥线钳孔的大小; 图 1E）。该原基将作为估计年轻原代大小和阶段的参考。P6因其大小范围和针状形态而成为玉米幼苗中最实用的参考。 用尺子测量从原基尖端到芽基的长度。记录测量结果。注意：原基的长度会略微高估，因为原基底部有几毫米的茎（图2A）。 叶原基的徒手切片和成像在约0.8倍放大倍率的体视显微镜下，将拍摄牢固地放在光滑的表面上，例如玻璃砧板或其他防刮擦材料。使用剃须刀片或手术刀在原基长度的所需点切割短片（0.25-0.8毫米）。 在目标区域上方进行初始切割以丢弃芽的远端部分，然后在目标区域周围获得薄切片。要进行干净的切割，请垂直于芽的刀片，然后以平滑、均匀的动作向内滑动。注意：对于较大的原基（P6或P7），可能有几毫米的切片余地。然而，对于较小的原基（P5及更早），1毫米可以在采样中产生显着差异，因为这些原基在芽基部的前几毫米内堆叠起来（见图2A，F-H）。建议使用双刃剃须刀片进行更精细的切片。注意：使用剃须刀片和手术刀时要小心，以避免任何意外割伤或受伤。 定期更换剃须刀片，因为叶鞘很容易使刀片变钝。每轮切片后，用湿巾覆盖芽，以防止样品变干。 将叶子部分安装在干净的载玻片（75 mm x 25 mm）上，使用移液管将一滴水（或50%甘油）直接涂在切片上，然后将盖玻片（22 mm x 22 mm）放在顶部。 如果使用荧光染料，请将染料溶液涂在切片上，将盖玻片放在顶部，然后根据需要孵育。注意：根据染料的类型，在继续下一步之前，可能需要额外的步骤来处理叶子部分。这些参考文献44,45,46,47提供了荧光染料在植物细胞成像中的一般细节和用途。细胞核染色荧光染料5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）已有效地用于玉米叶原基的横截面48。相比之下，质膜染色染料，如Fei Mao 4-64（FM 4-64）和碘化丙啶，不能产生令人满意的结果（图3A-D）。 将载玻片放在落射荧光或共聚焦激光扫描显微镜的载物台上，并根据需要调整焦点和设置以可视化荧光团30。有关用于选定玉米FP报告系的照明和图像采集设置，请参见 表1 。注意：厚切片可能会产生高水平的背景自发荧光。考虑一些有助于缓解此问题的成像和标本制备策略30,49（见表2）。注意：使用强光源和激光时要小心并佩戴防护眼镜，以降低眼睛受伤的风险。 以不同的放大倍率和检测通道（包括明场照明）通过叶片切片成像30。使用 4 倍放大倍率对整个横截面进行成像，使用 20 倍或 40 倍 放大倍率对特定组织进行成像。 减少落射荧光成像在较高放大倍率下的曝光时间，以保护样品免受快速光漂白（见 表1）。 捕获整个部分或特定感兴趣区域 （ROI） 的图像。如有必要，获取z-stack，它是在不同焦深30处捕获的一系列图像。 要获取z堆栈，首先确定样品中的上部和下部位置，然后确定必须在这些位置之间捕获的光学切片数量。光学部分越少，z 步长越大，即每个部分之间的距离。根据 FP 的特性和所使用的放大倍率，捕获 3 到 25 个 z 步长尺寸 在 1 到 12 μm 之间的光学切片，用于对玉米叶原基的横向切片进行成像。注意：要展平z堆栈，请使用适当的体积渲染技术50 ，该技术可以通过显微镜软件或使用ImageJ / FIJI34 来完成（参见步骤4.1和4.2）。 保存所有图像文件及其关联的元数据（如果可用）。 表1：用于选定玉米FP报告基因的荧光和共聚焦成像的照明和图像采集设置。 缩写：FP = 荧光蛋白;TRITC = 四甲基罗丹明;FITC = 异硫氰酸荧光素;WLL = 白光激光;氩离子=氩离子激光器;HyD = 混合探测器;AU = 通风单位;Hz = 赫兹，每秒扫描线数。 请按此下载此表格。 3. 玉米叶原基全坐骑成像 解剖原基并用纳米胶带制备载玻片如步骤1.1.3-1.1.4（图1A）所述，用小刀或一把剪刀在土壤表面下方的中胚叶处小心地切割幼苗，从而收集幼苗。 在解剖植物之前，用透明的双面纳米胶带（补充图S1H）准备载玻片（75 mm x 25 mm）。剪一块矩形纳米胶带并将其粘在干净的载玻片的中心。请勿取下胶带顶部的保护性塑料膜。注意：根据要成像的样品的大小确定要使用的磁带的大小（请参阅 补充图S1I，J中的超大样品示例）。纳米胶带有丙烯酸或聚氨酯凝胶材料可供选择。这两种类型对荧光和共聚焦成像都有效24。为防止胶带变色，请将其存放在黑暗的容器中，防止胶带长时间暴露在光线下。 通过用剥线钳去除老叶的上部来开始解剖芽，如步骤 2.1 中所述。 用中胚叶握住枝条，用牙探针小心地去除周围的叶子以提取原木。为此，从芽的底部取出叶子并一次展开一个，直到感兴趣的原基暴露出来。 或者，使用剥线钳通过在芽的基部区域进行切割来直接提取叶原基（补充图S1E-G）。注意：此方法具有更高的折断原基的风险。 安装和成像原基。从胶带上取下保护膜。将暴露的原基放在胶带上。使用剃须刀片切割基部的原基，丢弃基茎和下胚轴（图1F）。 使用带有弯曲针的牙科探针展开原基（尖端直径为0.25-0.6毫米）。使用微探针（尖端直径为0.15-0.2毫米）小于3毫米（P3至早期P4）的原基。 将针尖平行于表面放置并展开外基缘，轻轻将其按压在胶带上。 为了更顺利地展开，通过将针尖浸入 100% 甘油中来润滑叶子的内表面（近轴）。 将外边缘粘附在胶带上，将针尖平行于叶片的长轴对齐。轻轻地将针向侧面滑动以展开并将叶子压平到胶带上（图1F）。注意：展开时折断或损坏叶子很常见，特别是在具有强壮中脉的较大原基中（见图3E-G）。用力展开叶子会在成像过程中擦伤其表面并产生伪影（图 3H）。有关这些问题的建议解决方案，请参阅表 2 和讨论。 在展开的原木上滴一滴水。立即将盖玻片放在水滴和原基物的顶部。轻轻按下盖玻片的边缘，使其粘附在胶带上。注意：建议使用大的矩形盖玻片（50 mm x 24 mm或60 mm x 24 mm），并带有额外的区域以粘附在胶带上。尽量减少气泡的形成，气泡会扭曲叶片并导致光折射不均匀（见图3I-K）。确保盖玻片完全粘附在胶带上，因为安装的原基的边缘可能会在松散粘附的盖玻片下回滚（见图3L）。 将载玻片放在落射荧光（参见 补充图S1K）或共聚焦激光扫描显微镜的载物台上，并根据需要调整焦点和设置以可视化荧光团30。有关用于所选玉米FP报告株系的照明和图像采集设置，请参见 表1 。 通过各种检测通道对整个叶子或特定ROI进行成像30。要对整个叶片进行成像，请手动捕获叶片的马赛克图像，或使用显微镜在低放大倍率（4x或10x）下的平铺操作。注意：即使在最低放大倍率下，玉米叶原基也可能太大而无法用落射荧光或共聚焦激光扫描显微镜成像，导致成像时间更长，可能导致光漂白（见 图3M）或背景自发荧光增加。因此，建议使用荧光体视显微镜对大于5毫米的全叶样品进行成像。 对于共聚焦成像，需要获得包含叶片厚度的z堆栈（参见步骤2.2.9）。 保存所有图像文件及其关联的元数据（如果可用）。 表 2：对玉米叶原基的横向切片和整个支架进行成像的常见问题故障排除。请按此下载此表格。 图3：玉米叶原基的次优横截面和全安装制备。 （A-D）具有质膜标记PIP2-1-CFP（A）和质膜结合荧光染料FM 4-64（B）的叶原基横向切片的代表性共聚焦图像，以及相应的明场图像（C，D）。与PIP2-1-CFP相比，FM 4-64显示细胞轮廓的次优可视化。（E-M）整个叶原基的代表性荧光图像显示存在撕裂（E-G），瘀伤表面†（H），气泡*（I-K），回滚边缘（L）和光漂白区域‡（M）。叶原基表达DII-Venus（E-G），GAR2-YFP（H-J），mDII-Venus（K），PIN1a-YFP（L）和DR5-RFP（M）。比例尺 = 200 μm （A-D）;500微米（E-M）。图3A经Robil和McSteen24许可修改和复制，而图5B-M是作者未发表的数据。缩写：P = 塑体;YFP = 黄色荧光蛋白;RFP = 红色荧光蛋白;CFP = 青色荧光蛋白;PIP2-1-CFP = p Zm PIP2-1：：ZmPIP2-1：CFP;DII-Venus = pZmUbi：DII：YFP-NLS;GAR2-YFP = p Zm GAR2：：ZmGAR2：YFP;mDII-Venus = pZmUbi：mDII：YFP-NLS;PIN1a-YFP = p Zm PIN1a：：ZmPIN1a：YFP;DR5-RFP = DR5rev：：mRFPer;BF = 明场。请点击此处查看此图的大图。 4. 使用图像J/斐济处理图像 使用最大强度投影 （MIP） 展平 z 堆栈启动 ImageJ/FIJI 并打开图像堆栈，或通过选择 图像 |堆栈 | 从菜单中堆叠图像。 选择映像堆栈。从菜单中，选择“图像 |堆栈 |Z项目….在 Z 投影对话框中，从投影类型下拉菜单中选择最大强度。单击确定创建最大强度 z 投影。注意：展平图像是 z 堆栈50 上强度最高的像素的 2D 投影。该方法适用于可视化荧光基团，但不适用于厚横截面和全叶支架的明场图像中的解剖特征。 通过选择 “文件”|“ 将图像另存为 TIFF（标记图像文件格式）另存为 |蒂夫。输入文件的名称，然后单击 保存。注意：建议使用TIFF存储荧光和共聚焦图像，因为它在保存图像时保留质量和细节。 使用扩展景深 （EDF） 插件展平 z 轴堆栈51安装 EDF 插件52。从 http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ 下载 Extended_Depth_Field.jar 文件（版本 17.05.2021），并将其放在 ImageJ/FIJI 的“插件”文件夹中。 启动 ImageJ/FIJI 并打开图像堆栈，或通过选择 图像 |堆栈 | 从菜单中堆叠图像。 选择映像堆栈。从菜单中，选择 插件 |扩展景深 |法国电力公司简易模式。在“ 扩展景深 ”对话框中，使用“速度 /质量” 下的滑块设置所需的质量和处理速度，并使用 “高度贴图”reg 设置地形的平滑度级别。单击 “运行 ”以创建重建的映像。注意：EDF通过投影最佳焦点将堆栈组合成清晰的复合2D图像51。该技术可用于克服有限的焦深，适用于重建厚横截面或全叶安装的明场图像。应用此滤光片可视化荧光团时要小心，因为与MIP不同，EDF会调整图像的对比度，从而影响像素强度。 通过选择“ 文件”|”另存为 |蒂夫。输入文件的名称，然后单击 保存。 使用网格/集合拼接插件将图像拼接在一起53将要拼接在一起的图像或图像堆栈的集合保存在单个目录中。 启动 ImageJ/FIJI 并选择插件 |拼接 |菜单中的网格/集合拼接。在“网格/集合拼接”对话框中，从“类型”下拉菜单中选择“未知位置”，然后从“顺序”中选择“目录中的所有文件”。单击“确定”。 在“网格拼接： 未知位置，目录中的所有文件”对话框中，通过在“目录”文本字段中键入或粘贴目录路径或单击“浏览…”来查找目录来指定图像的位置。单击“确定”开始拼接过程。注意：网格/集合拼接插件中的未知位置选项通过分析一组连续图像的重叠区域从一组连续图像重建合成图像。因此，此选项对于拼接未使用切片扫描操作获得的横向截面或全叶安装的图像的马赛克非常有用。 拼接完成后，将出现一个新窗口，其中包含拼接后的图像。通过选择“ 文件”|”另存为 |蒂夫。输入文件的名称，然后单击 保存。注意：也可以使用显微镜软件中的图像重建命令或通过ImageJ/FIJI中的 生物格式导入选项 拼接2D和3D图像的大型蒙太奇。 使用“合并通道”命令组合多个通道启动 ImageJ/FIJI 并打开要合并的图像或图像堆栈。注意：可以先使用步骤 4.1 或 4.2 拼合映像堆栈。MIP通常推荐用于扁平化荧光基团通道，而EDF更适合于平坦的明场通道或其他具有不同焦深的通道。 使用图像调整图像的亮度和对比度 |调整 |亮度/对比度。使用滑块或输入字段调整参数，然后单击应用。或者，通过选择“处理”|”增强对比度….设置饱和像素的百分比，选择归一化，然后单击确定。注意：在量化或比较图像之间的荧光基团信号强度时，通常最好不要调整亮度或对比度，因为这会改变图像中的相对像素强度，从而影响测量和比较。 要区分通道，请使用查找表 （LUT） 将伪彩色应用于特定图像。为此，请选择图像，然后从 ImageJ/FIJI 菜单中选择 图像，单击查找 表，然后从下拉列表中选择适当的 LUT。 从菜单中，选择 “图像 |颜色 |合并频道。对于每个通道（C1、 C2、 C3…），使用下拉列表选择要分配给该通道的图像。单击“ 确定” 合并通道。 通过选择“ 文件”|”另存为 |蒂夫。输入文件的名称，然后单击 保存。