Align of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina(가시광선 광간섭 단층 촬영 파이버그램과 동일한 마우스 망막의 컨포칼 이미지 정렬)
Summary
본 프로토콜은 in vivo 이미지에서 관찰된 망막 신경절 세포 축삭 다발 형태를 검증하기 위한 목적으로 in vivo 가시광선 광간섭 단층 촬영 fibergraphy(vis-OCTF) 이미지를 동일한 마우스 망막의 ex vivo 공초점 이미지와 정렬하는 단계를 설명합니다.
Abstract
최근 몇 년 동안 생체 시스템 및 프로세스에 대한 비침습적, 실시간 및 종단 정보를 제공하는 생체 내 망막 영상이 안과 질환의 신경 손상에 대한 객관적인 평가를 얻기 위해 점점 더 많이 적용되고 있습니다. 동일한 망막의 생체 외 공초점 이미징은 특히 동물 연구에서 생체 내 결과를 검증하는 데 필요한 경우가 많습니다. 이 연구에서는 생쥐 망막의 생체 외 공초점 이미지를 생체 내 이미지와 정렬하는 방법을 시연했습니다. 가시광선 광간섭 단층 촬영 섬유촬영(vis-OCTF)이라는 새로운 임상 준비 이미징 기술을 적용하여 생쥐 망막의 생체 내 이미지를 획득했습니다. 그런 다음 “골드 스탠다드”와 동일한 망막의 컨포칼 이미징을 수행하여 in vivo vis-OCTF 이미지를 검증했습니다. 이 연구는 분자 및 세포 메커니즘에 대한 추가 연구를 가능하게 할 뿐만 아니라 생체 내 신경 손상에 대한 민감하고 객관적인 평가를 위한 기반을 마련합니다.
Introduction
망막 신경절 세포(RGC)는 시각 정보 처리에 중요한 역할을 하며, 내부 망상층(IPL)의 수지상 나무를 통해 시냅스 입력을 받고 망막 신경 섬유층(RNFL)의 축삭을 통해 뇌로 정보를 전달합니다 1,2,3,4. 녹내장과 같은 질병이 있는 상태에서, 초기 망막 신경절 변성은 환자와 설치류 모델 모두에서 RNFL, 신경절 세포층(GCL), IPL 및 시신경에 미묘한 변화를 초래할 수 있다 5,6,7,8,9. 따라서 망막 신경절 세포의 이러한 형태학적 변화를 조기에 발견하는 것은 망막 신경절 세포와 시력 상실을 예방하기 위한 적시 개입에 필수적입니다.
당사는 최근 망막 신경절 손상의 생체 내 모니터링에 대한 요구를 충족시키기 위해 가시광선 광간섭 단층촬영(vis-OCT)이라는 새로운 임상 지원 영상 기술을 개발했습니다. Vis-OCT는 망막10,11에서 1.3μm에 도달하여 축 분해능을 개선하여 RNFL에서 개별 망막 신경절 축삭 다발을 시각화할 수 있었습니다. 이어서, 마우스(11,12,13)에서 단일 축삭돌기 다발 수준에서 망막 신경절 손상을 추적하고 정량화하기 위해 vis-OCT 섬유학(vis-OCTF)을 확립하였다. 그러나 황금 표준과 동일한 망막의 생체 외 공초점 이미징은 생체 내 결과를 검증하는 데 필요한 경우가 많습니다. 따라서 본 연구는 vis-OCTF로 획득한 in vivo 이미지를 동일한 마우스 망막의 ex vivo 컨포칼 이미지와 정렬하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 생체 외 컨포칼 이미징을 통해 생체 내 결과를 검증하고 질병 상태에서 망막 신경절 손상의 기저에 있는 분자 및 세포 변화를 조사하기 위한 기반을 구축하는 것을 목표로 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에는 주의가 필요한 두 단계가 있습니다. 첫째, 동물이 깊은 마취 상태인지 확인하고 vis-OCT 영상 전에 눈이 완전히 확장되었는지 확인해야 합니다. 마우스가 적절하게 마취되지 않으면 빠른 호흡으로 인해 얼굴 이미지의 불안정한 움직임이 발생할 수 있으며, 이는 파이버그램의 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 불충분한 팽창은 홍채가 빛을 차단하여 망막에 도?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 녹내장 연구 재단 Shaffer Grant, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 및 Knights Templar Eye Foundation의 지원을 받습니다.
Materials
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
| Drugs and antibodies | |||
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
| Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
| Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) |
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
| Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (Reagent Grade) |
VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
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