Alinhamento de Fibrogramas de Tomografia de Coerência Óptica com Luz Visível com Imagens Confocais da Mesma Retina de Camundongo
Summary
O presente protocolo descreve os passos para o alinhamento in vivo de imagens de fibrografia por tomografia de coerência óptica de luz visível (vis-OCTF) com imagens confocais ex vivo da mesma retina de camundongos com o objetivo de verificar a morfologia do feixe axonal de células ganglionares da retina observada nas imagens in vivo.
Abstract
Nos últimos anos, a imagem in vivo da retina, que fornece informações não invasivas, em tempo real e longitudinais sobre sistemas e processos biológicos, tem sido cada vez mais aplicada para obter uma avaliação objetiva do dano neural em doenças oculares. Imagens confocais ex vivo da mesma retina são frequentemente necessárias para validar os achados in vivo , especialmente em pesquisas com animais. Neste estudo, demonstramos um método para alinhar uma imagem confocal ex vivo da retina de camundongos com suas imagens in vivo . Uma nova tecnologia de imagem pronta para uso clínico chamada fibra de tomografia de coerência óptica de luz visível (vis-OCTF) foi aplicada para adquirir imagens in vivo da retina de camundongos. Em seguida, realizamos a imagem confocal da mesma retina como “padrão ouro” para validar as imagens in vivo vis-OCTF. Este estudo não só permite uma investigação mais aprofundada dos mecanismos moleculares e celulares, mas também estabelece uma base para uma avaliação sensível e objetiva do dano neural in vivo.
Introduction
As células ganglionares da retina (CGRs) desempenham um papel crítico no processamento da informação visual, recebendo entradas sinápticas através de suas árvores dendríticas na camada plexiforme interna (LIP) e transmitindo a informação através de seus axônios na camada de fibras nervosas da retina (CFNR) para o cérebro 1,2,3,4. Em condições de doença como o glaucoma, a degeneração precoce do CGR pode resultar em alterações sutis na CFNR, na camada de células ganglionares (LCG), na LIP e no nervo óptico, tanto em pacientes quantoem modelos de roedores5,6,7,8,9. A detecção precoce dessas alterações morfológicas nos CGRs é, portanto, essencial para uma intervenção oportuna na prevenção do CGR e da perda da visão.
Recentemente, desenvolvemos uma nova tecnologia de imagem pronta para uso clínico chamada tomografia de coerência óptica com luz visível (vis-OCT) para satisfazer a necessidade de monitoramento in vivo dos danos do CGR. O Vis-OCT melhorou a resolução axial, atingindo 1,3 μm naretina10,11, permitindo a visualização de feixes axonais RGC individuais na CFNR. Posteriormente, a fibrografia vis-OCT (vis-OCTF) foi estabelecida para rastrear e quantificar o dano do CGR no nível do feixe axônio único emcamundongos 11,12,13. No entanto, imagens confocais ex vivo da mesma retina do padrão-ouro são frequentemente necessárias para validar os achados in vivo. Portanto, este estudo demonstrará como alinhar imagens in vivo adquiridas por vis-OCTF com imagens confocais ex vivo da mesma retina de camundongo. O protocolo visa validar os achados in vivo por imagens confocais ex vivo e estabelecer uma base para examinar as alterações moleculares e celulares subjacentes ao dano RGC em condições doentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Há duas etapas nesse protocolo que requerem atenção. Primeiro, é necessário garantir que o animal esteja sob anestesia profunda e que seus olhos estejam totalmente dilatados antes da realização de exames de OCT. Se os camundongos não estiverem adequadamente anestesiados, sua respiração rápida pode levar a movimentos instáveis das imagens da face em face , o que pode afetar negativamente a qualidade do fibrograma. Além disso, a dilatação insuficiente também pode ter um impacto negativo na qualidad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo é apoiado pela Fundação de Pesquisa em Glaucoma Shaffer Grant, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 e Knights Templar Eye Foundation.
Materials
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
| Drugs and antibodies | |||
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
| Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
| Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) |
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
| Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (Reagent Grade) |
VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
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