Allineamento di fibrogrammi per tomografia a coerenza ottica a luce visibile con immagini confocali della stessa retina murina
Summary
Il presente protocollo delinea i passaggi per l’allineamento in vivo delle immagini in fibra di tomografia a coerenza ottica a luce visibile (vis-OCTF) con le immagini confocali ex vivo della stessa retina murina allo scopo di verificare la morfologia osservata del fascio assonale delle cellule gangliari retiniche nelle immagini in vivo .
Abstract
Negli ultimi anni, l’imaging retinico in vivo, che fornisce informazioni non invasive, in tempo reale e longitudinali sui sistemi e sui processi biologici, è stato sempre più applicato per ottenere una valutazione obiettiva del danno neurale nelle malattie oculari. L’imaging confocale ex vivo della stessa retina è spesso necessario per convalidare i risultati in vivo , soprattutto nella ricerca sugli animali. In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo per allineare un’immagine confocale ex vivo della retina del topo con le sue immagini in vivo . Una nuova tecnologia di imaging clinicamente pronta chiamata fibragrafia per tomografia a coerenza ottica a luce visibile (vis-OCTF) è stata applicata per acquisire immagini in vivo della retina del topo. Abbiamo quindi eseguito l’imaging confocale della stessa retina come “gold standard” per convalidare le immagini in vivo vis-OCTF. Questo studio non solo consente ulteriori indagini sui meccanismi molecolari e cellulari, ma stabilisce anche le basi per una valutazione sensibile e obiettiva del danno neurale in vivo.
Introduction
Le cellule gangliari retiniche (RGC) svolgono un ruolo fondamentale nell’elaborazione delle informazioni visive, ricevendo input sinaptici attraverso i loro alberi dendritici nello strato plessiforme interno (IPL) e trasmettendo le informazioni tramite i loro assoni nello strato di fibre nervose retiniche (RNFL) al cervello 1,2,3,4. In condizioni patologiche come il glaucoma, la degenerazione precoce di RGC può provocare sottili cambiamenti nell’RNFL, nello strato di cellule gangliari (GCL), nell’IPL e nel nervo ottico sia nei pazienti che nei modellidi roditori 5,6,7,8,9. La diagnosi precoce di questi cambiamenti morfologici nelle RGC è quindi essenziale per un intervento tempestivo per prevenire le RGC e la perdita della vista.
Recentemente abbiamo sviluppato una nuova tecnologia di imaging clinicamente pronta chiamata tomografia a coerenza ottica a luce visibile (vis-OCT) per soddisfare la necessità di monitoraggio in vivo del danno RGC. Vis-OCT ha migliorato la risoluzione assiale, raggiungendo 1,3 μm nella retina10,11, consentendo la visualizzazione dei singoli fasci assoniali RGC nell’RNFL. Successivamente, è stata istituita la fibrografia vis-OCT (vis-OCTF) per tracciare e quantificare il danno RGC a livello di singolo fascio assonale nei topi11,12,13. Tuttavia, l’imaging confocale ex vivo della stessa retina del gold standard è spesso necessario per convalidare i risultati in vivo. Pertanto, questo studio dimostrerà come allineare le immagini in vivo acquisite da vis-OCTF con le immagini confocali ex vivo della stessa retina murina. Il protocollo mira a convalidare i risultati in vivo mediante imaging confocale ex vivo e stabilire una base per esaminare i cambiamenti molecolari e cellulari alla base del danno RGC in condizioni patologiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono due passaggi in questo protocollo che richiedono attenzione. Innanzitutto, è necessario assicurarsi che l’animale sia in anestesia profonda e che i suoi occhi siano completamente dilatati prima dell’imaging vis-OCT. Se i topi non sono adeguatamente anestetizzati la loro respirazione veloce può portare a movimenti instabili delle immagini en face , che possono influire negativamente sulla qualità del fibrogramma. Inoltre, una dilatazione insufficiente può anche avere un impatto negativo sulla qualità…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è supportato dalla Glaucoma Research Foundation Shaffer Grant, dal 4-CA Cavalier Collaborative Award, dalla R01EY029121, dalla R01EY035088 e dalla Knights Templar Eye Foundation.
Materials
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
| Drugs and antibodies | |||
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
| Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
| Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) |
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
| Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (Reagent Grade) |
VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
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