Ensayo de viabilidad de conidios de Trichoderma stromaticum dentro de macrófagos mononucleares derivados de sangre periférica humana
Summary
La técnica que implica la fagocitosis de conidios fúngicos por macrófagos es ampliamente utilizada para estudios que evalúan la modulación de las respuestas inmunes contra hongos. El propósito de este manuscrito es presentar un método para evaluar la fagocitosis y la capacidad de depuración de macrófagos mononucleares de sangre periférica humana estimulados con conidios de Trichoderma stromaticum .
Abstract
Los macrófagos representan una línea de defensa crucial y son responsables de prevenir el crecimiento y la colonización de patógenos en diferentes tejidos. La fagocitosis conidial es un proceso clave que permite la investigación de los eventos citoplasmáticos y moleculares implicados en las interacciones macrófago-patógeno, así como la determinación del momento de muerte de los conidios internalizados. La técnica que implica la fagocitosis de conidios fúngicos por macrófagos es ampliamente utilizada para estudios que evalúan la modulación de las respuestas inmunes contra hongos. La evasión de la fagocitosis y el escape de los fagosomas son mecanismos de virulencia fúngica. En este trabajo se presentan los métodos que se pueden utilizar para el análisis de la fagocitosis, aclaramiento y viabilidad de T. stromaticum conidia, un hongo que se utiliza como agente de biocontrol y biofertilizante y es capaz de inducir infecciones humanas. El protocolo consiste en 1) cultivo de Trichoderma , 2) lavado para obtener conidios, 3) el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) utilizando el método de solución de polisacarosa y la diferenciación de los PBMCs en macrófagos, 4) un método de fagocitosis in vitro utilizando cubreobjetos de vidrio redondos y coloración, y 5) un ensayo de aclaramiento para evaluar la viabilidad de los conidios después de la fagocitosis de los conidios. En resumen, estas técnicas se pueden utilizar para medir la eficiencia de eliminación de hongos de los macrófagos.
Introduction
El género Trichoderma (Orden: Hypocreales, Familia: Hypocreaceae) está compuesto por hongos saprófitos ubicuos que son parásitos de otras especies fúngicas y son capaces de producir una variedad deenzimas comercialmente útiles. Estas especies fúngicas se utilizan para la producción de proteínas heterólogas2, la producción de celulosa3, etanol, cerveza, vino y papel4, en la industria textil5, la industria alimentaria6 y en la agricultura como agentes de control biológico 7,8. Además del interés industrial en estas especies fúngicas, el creciente número de infecciones en humanos ha dado a algunas especies de Trichoderma el estatus de patógenos oportunistas9.
Trichoderma spp. crece rápidamente en cultivo, con colonias inicialmente blancas y algodonosas que se vuelven de color amarillo verdoso a verde oscuro10. Están adaptados a vivir en un amplio rango de condiciones de pH y temperatura, y las especies oportunistas son capaces de sobrevivir a pH y temperaturas fisiológicas y, por lo tanto, colonizar diferentes tejidos humanos 11,12,13. Es importante destacar que el aumento en la tasa de infección de Trichoderma spp. puede estar asociado con factores de virulencia, y estos no están bien estudiados. Además, los estudios centrados en la comprensión de la respuesta inmunitaria contra especies oportunistas de Trichoderma siguen siendo escasos.
Durante una infección, junto con los neutrófilos, los macrófagos representan la línea de defensa responsable de la fagocitosis y, por lo tanto, evitan el crecimiento y la colonización de patógenos en diferentes tejidos. Utilizando receptores de reconocimiento de patrones, como los receptores tipo Toll y los receptores de lectina de tipo C, los macrófagos fagocitan hongos y los procesan en fagolisosomas, promoviendo así un estallido respiratorio, la liberación de citoquinas proinflamatorias y la destrucción de los microorganismos fagocitados14. El mecanismo de fagocitosis, sin embargo, puede verse afectado y evadido por diferentes estrategias microbianas, como el tamaño y la forma de las células fúngicas; la presencia de cápsulas que dificultan la fagocitosis; disminuir el número de receptores inductores de fagocitosis; la remodelación de la estructura de las fibras de actina en el citoplasma; dificultar la formación de seudópodos; y el escape de fagosomas o fagolisosomas después del proceso de fagocitosis14.
Muchos patógenos, incluido Cryptococcus neoformans, utilizan los macrófagos como nicho para sobrevivir en el huésped, diseminarse e inducir la infección15. El ensayo de fagocitosis y aclaramiento se utiliza para evaluar la respuesta inmune frente a patógenos e identificar las estrategias microbianas empleadas para evadir el sistema inmune innato 15,16,17. Este tipo de técnica también se puede utilizar para examinar la cinética diferencial de la fagocitosis, la acidificación retardada del fagosoma y el estallido oxidativo que dan lugar a una reducción de la muerte fúngica18.
Se pueden utilizar diferentes métodos para evaluar la fagocitosis, la supervivencia fúngica y la evasión del proceso de maduración del fagosoma. Entre ellas se encuentran la microscopía de fluorescencia, que se utiliza para observar la fagocitosis, la ubicación celular y las moléculas producidas durante la fagocitosis19; citometría de flujo, que proporciona datos cuantitativos sobre la fagocitosis y se utiliza para evaluar los diferentes marcadores implicados en el proceso20,21; microscopía intravital, que se utiliza para evaluar la captura microbiana y la maduración del fagosoma22; fagocitosis mediada por anticuerpos, que se utiliza para evaluar la especificidad del proceso de fagocitosis de un patógeno23; y otros 24,25,26,27.
El protocolo presentado aquí emplea un método común, de bajo costo y directo que utiliza un microscopio óptico y un ensayo de crecimiento en placa para evaluar la fagocitosis y la eliminación de los conidios fúngicos. Este protocolo proporcionará a los lectores instrucciones paso a paso para realizar el ensayo de fagocitosis y aclaramiento utilizando macrófagos mononucleares derivados de sangre periférica humana expuestos a T. stromaticum. Los PBMC se utilizaron porque los conidios de Trichoderma se aplican como biocontrol contra fitopatógenos y biofertilizante para cultivos de plantas en todo el mundo y han causado varias infecciones humanas, llamadas Trichodermosis. Además, solo hay dos trabajos previos centrados en la interacción entre los conidios de Trichoderma y el sistema inmune humano, en los que examinamos los neutrófilos28 y la autofagia en macrófagos29. Este artículo muestra, en primer lugar, cómo se puede estudiar la fagocitosis de los conidios de T. stromaticum por macrófagos derivados de PBMC, y luego cómo se puede evaluar la viabilidad de los conidios engullidos utilizando técnicas simples basadas en microscopía. Este protocolo puede facilitar aún más las investigaciones sobre la respuesta inmunitaria asociada a macrófagos o los mecanismos relacionados con la modulación del sistema inmunitario.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para varios patógenos fúngicos, incluyendo Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans y otros, la fagocitosis conidial o de levadura es un proceso clave que permite la investigación de los eventos citoplasmáticos y moleculares en las interacciones macrófago-patógeno, así como la determinación del momento de muerte de los conidios internalizados 14,39,40. La fagocitosis es el proceso …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de las siguientes instituciones financieras brasileñas: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) con subvenciones RED0011/2012 y RED008/2014. U.R.S., J.O.C. y M.E.S.M. reconocen la beca otorgada por la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) y la FAPESB, respectivamente.
Materials
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | CLS431470 | 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile |
| 24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate | Kasvi | K12-024 | Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation; |
| Cell culture CO2 incubator | Sanyo | 303082 | A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types. |
| Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL | Capp | 5101500 | Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens |
| Circular coverslip 15 mm | Olen | K5-0015 | Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm |
| Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets | Esco Lifesciences group | 2010274 | Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface. |
| Dextrose Potato Agar medium | Merck | 145 | Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi |
| EDTA vacuum blood collection tube | FirstLab | FL5-1109L | EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology. |
| Entellan | Merck | 1.07961 | Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A2720801 | Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells. |
| Flaticon | database of images | ||
| Glycerol | Merck | 24900988 | The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores |
| Histopaque-1077 | polysucrose solution | ||
| Image J | Image analysis software | ||
| Microscopy slides | Precision | 7105 | Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections |
| Mini centrifuge | Prism | C1801 | The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time. |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0011 | The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles. |
| Panoptic fast | Laborclin | 620529 | Laborclin's panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology |
| Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U | LGC- Biotechnology | BR3011001 | antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow. |
| Petri dish 90 x 15 mm Smooth | Cralplast | 18248 | Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | thermo fisher Scientific | 10010001 | PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells. |
| Pipette Pasteur 3 mL Sterile | Accumax | AP-3-B-S | STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile |
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | TS-HM16R | The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g. |
| RPMI-1640 Medium | Merck | MFCD00217820 | HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| The single channel micropipettes | Eppendorf | Z683809 | Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids. |
| Tip for Micropipettor | Corning | 4894 | Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable |
| Triocular inverted microscope | LABOMED | VU-7125500 | It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems. |
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