Ensaio de viabilidade de conídios de Trichoderma stromaticum dentro de macrófagos mononucleares derivados do sangue periférico humano

O gênero Trichoderma (Ordem: Hypocreales, Família: Hypocreaceae) é composto por fungos ubíquos e saprofíticos, parasitas de outras espécies fúngicas e capazes de produzir uma variedade de enzimas comercialmente úteis¹. Essas espécies fúngicas são utilizadas para a produção de proteínas heterólogas², produção de celulose³, etanol, cerveja, vinho e papel⁴, na indústria têxtil⁵, na indústria alimentícia⁶ e na agricultura como agentes de controle biológico ^7,8. Além do interesse industrial nessas espécies fúngicas, o crescente número de infecções em humanos tem conferido a algumas espécies de Trichoderma o status de patógenos oportunistas⁹.

cresce rapidamente em cultura, com colônias inicialmente brancas e cotonosas que se tornam amarelo-esverdeadas a verde-escuras¹⁰. Eles são adaptados para viver em uma ampla gama de condições de pH e temperatura, e as espécies oportunistas são capazes de sobreviver a pH e temperaturas fisiológicas e, assim, colonizar diferentes tecidos humanos 11,12,13. É importante ressaltar que o aumento na taxa de infecção de Trichoderma spp pode estar associado a fatores de virulência, que não são bem estudados. Além disso, estudos focados no entendimento da resposta imune contra espécies oportunistas de Trichoderma ainda são escassos.

Durante uma infecção, juntamente com os neutrófilos, os macrófagos representam a linha de defesa responsável pela fagocitose e, assim, impedem o crescimento e a colonização de patógenos em diferentes tecidos. Utilizando receptores de reconhecimento padrão, como receptores Toll-like e receptores de lectina tipo C, os macrófagos fagocitam fungos e os processam em fagolisossomos, promovendo burst respiratório, liberação de citocinas pró-inflamatórias e destruição dos microrganismos fagocitados¹⁴. O mecanismo de fagocitose, entretanto, pode ser afetado e evitado por diferentes estratégias microbianas, tais como o tamanho e a forma das células fúngicas; a presença de cápsulas que dificultam a fagocitose; diminuição do número de receptores indutores de fagocitose; a remodelação da estrutura das fibras de actina no citoplasma; dificultar a formação de pseudopódios; e escape do fagossomo ou fagolisossomo após o processo de fagocitose¹⁴.

Muitos patógenos, incluindo o Cryptococcus neoformans, utilizam macrófagos como nicho para sobreviver no hospedeiro, disseminar e induzir infecção¹⁵. O ensaio de fagocitose e depuração é utilizado para avaliar a resposta imune contra patógenos e identificar as estratégias microbianas empregadas para evadir o sistema imune inato 15,16,17. Esse tipo de técnica também pode ser usado para examinar a cinética diferencial de fagocitose, acidificação retardada do fagossomo e explosão oxidativa que resultam em redução da morte fúngica¹⁸.

Diferentes métodos podem ser utilizados para avaliar a fagocitose, a sobrevivência fúngica e a evasão do processo de maturação do fagossomo. Entre elas estão a microscopia de fluorescência, que é utilizada para observar a fagocitose, a localização celular e as moléculas produzidas durante a fagocitose¹⁹; a citometria de fluxo, que fornece dados quantitativos sobre a fagocitose e é utilizada para avaliar os diferentes marcadores envolvidos no^{processo20,21}; microscopia intravital, que é utilizada para avaliar a captura microbiana e a maturação do^fagossomo22; fagocitose mediada por anticorpos, que é usada para avaliar a especificidade do processo de fagocitose para um patógeno²³; e outros 24,25,26,27.

O protocolo aqui apresentado emprega um método comum, de baixo custo e direto, usando microscópio óptico e ensaio de crescimento em placa para avaliar a fagocitose e a morte de conídios fúngicos. Este protocolo fornecerá aos leitores instruções passo a passo para a realização do ensaio de fagocitose e depuração utilizando macrófagos mononucleares de sangue periférico humano expostos ao T. stromaticum. As CMSP foram utilizadas porque os conídios de Trichoderma são aplicados como biocontrole contra fitopatógenos e biofertilizante para culturas vegetais em todo o mundo e têm causado diversas infecções humanas, denominadas Tricodermoses. Além disso, existem apenas dois trabalhos anteriores enfocando a interação entre conídios de Trichoderma e o sistema imunológico humano, nos quais examinamos neutrófilos²⁸ e autofagia em macrófagos²⁹. Este artigo mostra primeiramente como a fagocitose dos conídios de T. stromaticum por macrófagos derivados de CMSP pode ser estudada e, em seguida, como a viabilidade dos conídios engolidos pode ser avaliada usando técnicas simples baseadas em microscopia. Esse protocolo pode facilitar ainda mais as investigações sobre a resposta imune associada a macrófagos ou mecanismos relacionados à modulação do sistema imune.