JoVE Journal > Immunology and Infection
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免疫与感染

Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages의 생존력 분석

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65231
, , , ,
1Laboratory of Immunobiology – Department of Biological Sciences,State University of Santa Cruz – UESC, 2Università Degli Studi di Genova

Summary

대식세포에 의한 진균 분생포자의 식세포작용과 관련된 기술은 진균에 대한 면역 반응의 조절을 평가하는 연구에 널리 사용됩니다. 본 논문의 목적은 Trichoderma stromaticum conidia로 자극된 인간 말초혈액 단핵 유래 대식세포의 식균작용 및 제거 능력을 평가하는 방법을 제시하는 것이다.

Abstract

대식세포는 중요한 방어선을 나타내며 다른 조직에서 병원체의 성장과 집락화를 방지하는 역할을 합니다. 분쇄자 식균작용은 대식세포-병원체 상호 작용과 관련된 세포질 및 분자 사건을 조사하고 내재화된 분생포자의 사망 시간을 결정할 수 있는 핵심 과정입니다. 대식세포에 의한 진균 분생포자의 식세포작용과 관련된 기술은 진균에 대한 면역 반응의 조절을 평가하는 연구에 널리 사용됩니다. 식세포작용(phagocytosis)의 회피와 식세포(phagosome)의 탈출은 곰팡이 독성의 기전입니다. 여기에서는 생물 방제 및 생물 비료로 사용되며 인간 감염을 유도할 수 있는 곰팡이인 T. stromaticum conidia의 식균작용, 제거 및 생존력 분석에 사용할 수 있는 방법을 보고합니다. 프로토콜은 1) Trichoderma 배양, 2) 분생포자를 얻기 위한 세척, 3) 다자당 용액법을 사용한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 분리 및 PBMC를 대식세포로 분화, 4) 둥근 유리 커버슬립 및 착색을 사용한 시험관 내 식세포작용 방법, 5) 분생포자 식균작용 후 분생포자 생존력을 평가하기 위한 클리어런스 분석으로 구성됩니다. 요약하면, 이러한 기술은 대식세포의 곰팡이 제거 효율을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

Trichoderma 속(목: Hypocreales, 과: Hypocreaceae)은 다른 곰팡이 종의 기생충인 유비쿼터스 부생균으로 구성되어 있으며 상업적으로 유용한 다양한 효소를 생산할 수 있습니다1. 이들 곰팡이 종은 이종 단백질2의생산, 셀룰로오스3, 에탄올, 맥주, 와인, 종이4의 생산, 섬유산업5, 식품산업6, 농업에서 생물학적 방제제7,8의 생산에 사용된다. 이러한 곰팡이 종에 대한 산업적 관심과 더불어, 인간의 감염 건수가 증가함에 따라 일부 Trichoderma 종은 기회주의적 병원체의 지위를 부여받았다9.

Trichoderma spp.는 배양에서 빠르게 성장하며, 처음에는 흰색과 솜털 같은 군체가 녹색을 띤 노란색에서 짙은 녹색으로 변한다10. 그들은 광범위한 pH 및 온도 조건에서 살도록 적응되어 있으며, 기회 주의적 종은 생리적 pH 및 온도에서 생존 할 수 있으므로 다른 인간 조직을 식민지화할 수 있습니다 11,12,13. 중요한 것은 Trichoderma spp.의 감염률 증가가 독성 요인과 관련이 있을 수 있지만 이러한 요인은 잘 연구되지 않았다는 것입니다. 또한 기회주의적 Trichoderma 종에 대한 면역 반응을 이해하는 데 초점을 맞춘 연구는 여전히 드뭅니다.

감염 중에 호중구와 함께 대식세포는 식세포작용을 담당하는 방어선을 나타내므로 다른 조직에서 병원체의 성장과 집락화를 방지합니다. 톨 유사 수용체(Toll-like receptor) 및 C형 렉틴 수용체(lectin receptor)와 같은 패턴 인식 수용체를 이용하여, 대식세포는 식세포당 균류를 식세포(phagolysosome)로 처리하여 호흡 파열, 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 방출 및 식세포화된 미생물의 파괴를 촉진한다14. 그러나 식세포작용의 메커니즘은 곰팡이 세포의 크기와 모양과 같은 다양한 미생물 전략에 의해 영향을 받고 회피될 수 있습니다. 식균작용을 방해하는 캡슐의 존재; 식세포작용 유도 수용체의 수를 감소시키는 단계; 세포질에서 액틴 섬유의 구조 리모델링; pseudopodia의 형성을 방해하는 것; 그리고 phagocytosis 과정 후에 phagosome 또는 phagolysosome이 탈출한다14.

크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)를 포함한 많은 병원체는 대식세포를 틈새시장으로 사용하여 숙주에서 생존하고, 전파하고, 감염을 유도한다15. 식균작용 및 제거 분석은 병원체에 대한 면역 반응을 평가하고 선천성 면역 체계를 회피하는 데 사용되는 미생물 전략을 식별하는 데 사용됩니다 15,16,17. 이러한 유형의 기술은 또한 식균 사멸을 감소시키는 식세포작용, 지연된 식세포 산성화 및 산화 폭발의 차등 역학을 조사하는 데 사용할 수 있습니다18.

식세포작용, 곰팡이 생존 및 식세포 성숙 과정의 회피를 평가하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있습니다. 여기에는 식세포작용(phagocytosis), 세포 위치 및 식세포작용(phagocytosis) 동안 생성된 분자를 관찰하는 데 사용되는 형광 현미경이 포함됩니다19; 식세포작용(phagocytosis)에 대한 정량적 데이터를 제공하고 공정에 관련된 상이한 마커를 평가하는데 사용되는 유세포 분석법(flow cytometry); 미생물 포획 및 식좀 성숙을 평가하는데 사용되는 생체 내 현미경검사법 22; 병원체에 대한 식세포작용 과정의 특이성을 평가하는데 사용되는 항체-매개 식세포작용(antibody-mediated phagocytosis)23; 및 기타 24,25,26,27.

여기에 제시된 프로토콜은 곰팡이 분생포자의 식세포작용 및 사멸을 평가하기 위해 광학 현미경과 플레이트 성장 분석을 사용하는 일반적이고 저렴하며 직접적인 방법을 사용합니다. 이 프로토콜은 T. stromaticum에 노출된 인간 말초 혈액 단핵 유래 대식세포를 사용하여 식균작용 및 제거 분석을 수행하기 위한 단계별 지침을 독자에게 제공합니다. PBMC는 Trichoderma conidia가 전 세계적으로 식물 병원균에 대한 생물 방제 및 식물 작물의 생물 비료로 적용되고 Trichodermosis라고 하는 여러 인간 감염을 일으켰기 때문에 사용되었습니다. 그 외에도 Trichoderma conidia와 인간 면역 체계 사이의 상호 작용에 초점을 맞춘 이전 연구는 대식세포29에서 호중구(neutrophils)28와 자가포식(autophagy)을 조사한 두 가지 이전 연구뿐이다. 이 논문은 먼저 PBMC 유래 대식세포에 의한 T. stromaticum의 분생포자의 식세포작용을 연구할 수 있는 방법을 보여준 다음 간단한 현미경 기반 기술을 사용하여 삼킨 분생포자의 생존력을 평가할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 대식세포 관련 면역 반응 또는 면역 체계 조절 관련 메커니즘에 대한 연구를 더욱 용이하게 할 수 있습니다.

Protocol

윤리적 고려 사항 및 인간 주제이 연구에서 기술된 인간을 대상으로 한 모든 실험은 헬싱키 선언 및 브라질 연방법에 따라 수행되었으며 산타크루즈 주립대학교 윤리위원회(프로젝트 식별 코드: 550.382/2014)의 승인을 받았습니다. 인간 말초 혈액은 연구된 곰팡이와 관련된 직업 활동에 노출되지 않은 브라질 바이아(Bahia)의 일레우스(Ilhéus) 시의 건강한 지원자로…

Representative Results

대식세포에 의한 진균 분생포자의 식세포작용과 관련된 기술은 진균에 대한 면역 반응의 조절을 평가하는 연구에 널리 사용됩니다. 식세포작용(phagocytosis)의 회피와 식세포(phagosome)의 탈출이 진균 독성의 기전이기 때문에 식세포작용(phagocytosis) 후 분생포자의 생존력을 평가하기 위해 T. stromaticum conidia의 식세포작용(phagocytosis)을 사용했다. 연구자들은 임상적 관심 종을 조사할 때 첫 번째 분…

Discussion

아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 크립토코커스(Cryptococcus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 등을 포함한 여러 진균 병원체의 경우, 분추형 또는 효모 식균작용은 대식세포-병원체 상호작용에서 세포질 및 분자 사건을 조사하고 내재화된 분생포자의 사망 시간을 결정할 수 있는 핵심 과정입니다 14,39,40.<sup class="xre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 RED0011/2012 및 RED008/2014 보조금을 받은 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia(FAPESB)와 같은 브라질 금융 기관의 지원을 받았습니다. U.R.S., J.O.C. 및 M.E.S.M.은 각각 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior(CAPES) 및 FAPESB에서 수여하는 장학금을 인정합니다.

Materials

15 mL centrifuge tubes Corning CLS431470 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate Kasvi K12-024 Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator Sanyo 303082 A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL Capp 5101500 Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm Olen K5-0015 Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets Esco Lifesciences group 2010274 Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium Merck 145 Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube FirstLab FL5-1109L EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan Merck 1.07961  Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum Gibco A2720801 Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon  database of images
Glycerol Merck 24900988 The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077 polysucrose solution
Image J  Image analysis software
Microscopy slides Precision 7105 Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge Prism C1801 The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber Kasvi K5-0011 The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast  Laborclin 620529 Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U LGC- Biotechnology  BR3011001 antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth Cralplast 18248 Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS) thermo fisher Scientific 10010001 PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile Accumax AP-3-B-S STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific TS-HM16R The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium Merck MFCD00217820 HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes Eppendorf Z683809 Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor Corning 4894 Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope LABOMED VU-7125500 It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.
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TrichodermaMacrophagesPhagocytosisImmune SystemViability AssayConidial ClearanceBiocontrol AgentPathogenicityPeripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs)

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dos Santos, U. R., de Castro, J. O., Santos Matos, M. E., De Bonis, G., dos Santos, J. L. Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (200), e65231, doi:10.3791/65231 (2023).
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