JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物学

Bitkilerde Molekül Dağıtımı için Doğrudan İnfüzyon Cihazı

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/65194
, , , , , ,
1United States Department of Agriculture Agricultural Research Service U.S. Horticultural Research Laboratory, 2Agrosource Incorporated

Summary

Bu el yazmasında, moleküllerin bakterilere (Candidatus Liberibacter asiaticus) veya böcek vektörüne (Diaphorina citri, Kuwayama) karşı etkinliğini taramak için yeni bir doğrudan bitki infüzyon cihazı tanımlanmaktadır.

Abstract

Bitkilerde terapötik bileşiklerin işlevinin test edilmesi, tarımsal araştırmanın önemli bir bileşenidir. Yaprak ve toprak damlatma yöntemleri rutindir, ancak değişken alım ve test edilen moleküllerin çevresel parçalanması gibi dezavantajları vardır. Ağaçların gövde enjeksiyonu iyi bilinmektedir, ancak bunun için çoğu yöntem pahalı, tescilli ekipman gerektirir. Huanglongbing için çeşitli tedavileri taramak için, bu bileşikleri, floem sınırlı bakteri Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) ile enfekte olmuş veya floem besleyen CLas böcek vektörü Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) ile enfekte olmuş küçük serada yetiştirilen narenciye ağaçlarının vasküler dokusuna iletmek için basit, düşük maliyetli bir yönteme ihtiyaç vardır.

Bu tarama gereksinimlerini karşılamak için, tesisin gövdesine bağlanan bir doğrudan bitki infüzyonu (DPI) cihazı tasarlanmıştır. Cihaz, naylon tabanlı bir 3D baskı sistemi ve kolayca elde edilebilen yardımcı bileşenler kullanılarak yapılmıştır. Bu cihazın bileşik alım etkinliği, floresan marker 5,6-karboksifloresein-diasetat kullanılarak narenciye bitkilerinde test edilmiştir. Markörün bitkiler boyunca düzgün bileşik dağılımı rutin olarak gözlenmiştir.

Ayrıca, bu cihaz sırasıyla CLas ve D. citri üzerindeki etkilerini belirlemek için antimikrobiyal ve böcek öldürücü moleküller vermek için kullanıldı. Aminoglikozit antibiyotik streptomisin, cihaz kullanılarak CLas ile enfekte olmuş narenciye bitkilerine verildi ve bu da CLas titresinde tedaviden 2 haftadan 4 haftaya kadar bir azalmaya neden oldu. Neonikotinoid insektisit imidacloprid’in D. citri istilasına uğramış narenciye bitkilerine verilmesi, 7 gün sonra psyllid mortalitesinde önemli bir artışa neden olmuştur. Bu sonuçlar, bu DPI cihazının, molekülleri test etmek ve araştırma ve tarama amaçlarını kolaylaştırmak için bitkilere iletmek için yararlı bir sistemi temsil ettiğini göstermektedir.

Introduction

Bitkilerin ticari ve peyzaj ortamlarında yönetimi genellikle bitki büyümesini ve sağlığını optimize etmek için kimyasal bileşiklerin kullanılmasını gerektirir. Bu moleküllerin nasıl verildiği, molekülün türüne, molekülün işlevine, bitkinin türüne ve mevcut yönetim sistemine bağlıdır. Yaprak ve toprak uygulamaları en kolay dağıtım stratejileridir, ancak bazı moleküllerin alımındaki sınırlamalar doğrudan teslimatı gerektirir. Bu moleküllerin bir örneği, bitki içinde sistemik olarak hareket ettiklerinde en iyi şekilde işlev gören ancak basit topikal uygulamalarla etkili bir şekilde sağlanamayan terapötik moleküllerdir1. Bu, narenciye yeşillendirme hastalığı olarak da adlandırılan Huanglongbing (HLB) için geçerlidir. HLB, bitkinin dışında kültürlenemeyen floem sınırlı bir bakteri olan Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) veya böcek vektörü Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2 ile ilişkili bir hastalıktır.

Varsayılan terapötik moleküller gen ürünleri ise, bu bileşikleri ifade eden transgenik bitkiler oluşturularak test edilebilirler. Bununla birlikte, transgenik bitki üretimi zaman ve kaynak yoğun olabilir, oldukça genotipe bağımlıdır ve gen susturma3 ile inhibe edilebilir. Ek olarak, bu transgenikler umut verici sonuçlar gösterse bile, düzenleyici ve kamusal algı kısıtlamaları ticari kabul edilme olasılığını azaltır 4,5. Bununla birlikte, bileşiklerin eksojen uygulaması, biyolojik ve sentetik moleküllerin test edilmesini basitleştirir, çünkü bir molekülün etkilerini test etmek için zaman ve kaynakları azaltan kararlı veya geçici olarak eksprese eden transgenik bitkilerin üretimini gerektirmez. Eksojen bileşiklerin etkili ve verimli sistemik bitki dağıtımı için bir yöntem, çok çeşitli araştırma ve tarama amaçları için kullanılabilir.

Bu uygulamalardan biri, bir bitkinin vasküler sistemi içindeki sistemik molekül hareketinin analizidir; bu, floresan, görünür veya benzersiz kimyasal izotoplar 6,7,8,9 olsun, izlenebilir belirteçler kullanılarak yapılabilir. Yaygın olarak kullanılan bir floresan belirteç, hücre içi esterazlar tarafından 5,6-karboksifloresein (CF) içine parçalanan ve daha sonra floresan ve membran geçirimsiz10 haline gelen membran geçirgen bir boya olan 5,6-karboksifloresein-diasetattır (CFDA). CFDA, floem taşınımını, lavabo ve kaynak ilişkilerini ve bitki dokusundaki vaskülatür paternini izlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır11,12.

Bu belirteçlere ek olarak, bazı bileşikler verimliliği artırmak veya herbisitler durumunda bitkiyi öldürmek için bitkinin fizyolojisini doğrudan değiştirebilir. Hem insektisitler hem de antimikrobiyal bileşikler, özellikle HLB varlığında bitki verimliliğini arttırmanın bir yoludur. CLas’ı kontrol etmek için kullanılan bir antimikrobiyal molekülün bir örneği streptomisin’dir. Streptomisin, başlangıçta Streptomyces griseus’tan izole edilen ve protein biyosentezinin inhibisyonu yoluyla bakteriyel büyümeyi inhibe ettiği gösterilen bir aminoglikozit antibiyotiğidir13. İnsektisitler açısından, HLB araştırmasının ana hedefi, CLas’ı ağaçtan ağaca ileten D. citri’dir 14. Bu amaçla, imidakloprid gibi neonikotinoidler, böcek zararlılarını kontrol etmek için altın standart oldukları için yaygın olarak kullanılmaktadır15. Tüm bu çeşitli kullanımlar, mevcut tesis yönetimi stratejilerinin önemli yönleridir ve yeni ürünlerin geliştirilmesi, verimli tarama analizlerine bağlıdır.

Bileşiklerin odunsu bitkilere sokulması için kullanılan bir yöntem, gövdeye doğrudan enjeksiyondur. Önceden delinmiş enjeksiyon bölgeleri için ihtiyaçlarına göre değişen çeşitli sistemler tasarlanmıştır ve bu sistemler basınca dayalı enjeksiyon veya pasif akışkullanır 16. Basınca dayalı sistemler belirli bir bileşiğin hızlı bir şekilde sokulmasına izin vermesine rağmen, sıvıyı bloke edilmiş veya embolize edilmiş vaskülatür yoluyla zorlamanın neden olduğu potansiyel fiziksel hasarın dikkate alınması gerekir17. Bileşiklerin yaprak veya damla damlası uygulamasının uygulanması daha az zaman alıcı olmasına rağmen, doğrudan bitki enjeksiyonu, hava veya toprağa verilen zararlar nedeniyle ilgilenilen bileşiğin israfını azaltır ve ayrıca bileşiklerin dış ortama maruz kalmayı azaltarak aktif bir durumda olduğu süreyi uzatabilir18. Bu yönlerin her ikisi de pahalı reaktifleri korumak ve araştırma ortamlarında replikalar arasında tutarlılık sağlamak için önemlidir.

Bu çalışma, ilgilenilen bileşiklerin bir konakçı bitkiyi nasıl etkilediğini değerlendirmek için kullanılabilecek yenilikçi bir doğrudan bitki infüzyonu (DPI) cihazının tasarımını, yapımını ve kullanımını açıklamaktadır. Hem cihazın kendisini hem de yapımıyla ilişkili çeşitli bileşenleri üretmek için standart bir 3D yazıcı kullanıldı. Bu şirket içi inşaat yöntemi, araştırmacıların cihazı ve cihaz bileşenlerini kendi özel deneysel ihtiyaçlarına göre değiştirmelerine olanak tanır ve ticari olarak temin edilebilen bitki enjeksiyon cihazlarına olan bağımlılığı azaltır. Cihaz kurulumu basit ve verimlidir ve tüm yardımcı bileşenler kolayca temin edilebilir ve ucuzdur. Sistem çeşitli bitki türleriyle kullanılmak üzere tasarlanmış olmasına rağmen, burada sunulan örnekler saksı narenciye bitkileri ile ilgilidir. Ek olarak, bu çalışma, bu cihazın ölümcül olmasına neden olmadan genç narenciye bitkilerine sistematik olarak birden fazla bileşik türünü verimli bir şekilde verebildiğini göstermektedir. Test edilen bileşikler, bitkideki bileşik dağılımını değerlendirmek için kullanılan CFDA’yı ve bu bileşiklerin antimikrobiyal ve böcek öldürücü etkilerinin DPI yoluyla verildiğinde gözlemlendiğini doğrulamak için kullanılan streptomisin ve imidakloprid’i içeriyordu.

Protocol

1. Deneysel bileşik enjeksiyonu için narenciye bitkilerinin üretimi Küçük saksı narenciye ağaçlarını köklü vejetatif kesimlerden veya tohumlardan çoğaltın. Saksı narenciye hatlarını 16 saat/8 saat aydınlık/karanlık gün boyu ve 28 °C’de büyütün. Deney için uygun büyüklükteki narenciye bitkilerini seçin. Tarif edilen uygulamalar, bitkilerin 12 cm ile 100 cm yüksekliğinde, gövde çapları 4-14 mm arasında olmasını gerektirmiştir. Yeni yıkama büyümesi gerekiyorsa, deneyden önce bitkileri kesin. 2. DPI cihazının ve kalıp bileşenlerinin üç boyutlu baskısı Baskı yatağına ince bir polivinil asetat bazlı yapıştırıcı tabakası uygulayın. Naylon filamenti 3D yazıcıya yükleyin ve yazıcıyı üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. İstenilen şeyi içe aktarın. STL dosyası (Ek Dosya 1, Ek Dosya 2, Ek Dosya 3, Ek Dosya 4, Ek Dosya 5, Ek Dosya 6, Ek Dosya 7, Ek Dosya 8, Ek Dosya 9, Ek Dosya 10, Ek Dosya 11, Ek Dosya 12, Ek Dosya 13 ve Ek Dosya 14), ayarlayın ve yazdırmaya başlayın. Parçayı baskı yatağından çıkarın. Polivinil asetat bazlı yapıştırıcıyı basılı bileşenin tabanından suyla durulayın ve destek yapılarını çıkarın. DPI bileşenini iki kat şeffaf parlak sprey boya ile püskürtün. 3. Plastisol halka kalıbının imalatı Bir taban üzerinde birbirine yapışmış plastik bloklar kullanarak dikdörtgen bir muhafaza oluşturarak desen parçalarını tutacak kadar büyük bir kalıp formunu birleştirin (Ek Şekil S1A). RTV silikon monomerini ve katalizörü 10: 1 oranında karıştırın ve 1 dakika boyunca kabarcık sokmadan karıştırın. Gıda boyası (3 damla/25 mL silikon karışımı) ve el sabunu (1 mL sabun/25 mL silikon karışımı) ekleyerek renklendirin (Ek Şekil S1B). Tabanı tamamen örtmek için yeterli olan kalıp formuna ince bir silikon tabakası dökün. Yüzeyi düzleştirmek için bastırın ve silikonun ayarlanması için 24 saat bekleyin (Ek Şekil S1C). Yukarıda açıklandığı gibi, desen üzerindeki orta delik çekirdek baskısını kaplayacak kadar derin olan ikinci bir silikon tabakası dökün ( Ek Şekil S1D’de desenin üst kısmında görülebilir). Deseni, orta delikli çekirdek baskısı aşağı bakacak şekilde sıvı silikona yerleştirin. Hiçbir kabarcığın sıkışmadığından ve desenlerin iyi ayrıldığından ve dokunmadığından emin olun (Ek Şekil S1E). Desenleri, ayarlanırken silikondan dışarı kaymalarını önlemek için ağır bir nesne ve / veya bantla sabitleyin. Yeni dökülen tabakanın ayarlanması için 24 saat bekleyin (Ek Şekil S1F). Seviye desenin üst kısmıyla aynı hizaya gelene kadar ek silikon katmanları dökün. İyileşmek için 24 saat bekleyin (Ek Şekil S1G). Kalıbı serbest bırakmak için birbirine yapışmış plastik blokları sökün. Desenleri kaldırın (Ek Şekil S1H). Kalıbı yırtılma veya deformitelere karşı kontrol edin (Ek Şekil S1I). 4. Plastisol halkalarının dökümü Kalıbın iç kısmını, tüm çekirdek bileşenlerini ve O-ringleri yemeklik yağ ile kaplayın (Ek Şekil S2A, B). Orta direk çekirdeğinin ortasındaki çentiğin etrafına bir O-halka yerleştirin ve çekirdeği plastisol halka kalıbının orta deliğine yerleştirin (Ek Şekil S2C). Dağıtım kanalı çekirdeğini plastisol halka kalıbının yanındaki deliğe yerleştirin. Dağıtım kanalı çekirdeğinin sonundaki V şeklindeki ucu, orta direk çekirdeğindeki O-halkası ile hizalanacak şekilde yönlendirin (Ek Şekil S2D,E). Plastisol’ü mikrodalgada 10 sn’lik kısa patlamalar için ısıtın (Ek Şekil S2F, G). Kabarcıkları önlemek için plastisol hafifçe karıştırın (Ek Şekil S2H). Çözelti 160 °C ile 170 °C arasında bir sıcaklığa ulaşana kadar ısıtmayı ve karıştırmayı tekrarlayın (Ek Şekil S2I).DİKKAT: Plastisolün aşırı ısınması toksik dumanların salınmasına neden olabilir. Prosedürü iyi havalandırılan bir alanda veya duman davlumbazında gerçekleştirin. Plastisol’ü 170 °C’nin üzerinde ısıtmayın. Erimiş plastisolü, kabarcıklar sokmadan kalıbın dış kenarına yakın plastisol halka kalıbına dökün (Ek Şekil S2J). Plastisol halkalarının soğuması için 1 saat bekleyin (Ek Şekil S2K). Halkaları kalıptan çıkarın. Deneysel testlerde kullanmadan önce DPI cihazına uygun şekilde oturduğundan emin olun (Ek Şekil S2L). 5. DPI cihazının tesise bağlanması Cihaz bağlantısı için bagajda pürüzsüz, sağlıklı bir yer bulun. Herhangi bir çarpma veya düğümden kaçının, çünkü bunlar cihaz sızıntısına katkıda bulunabilir. Gövde yüzeyi ile 90° açıyla gövdenin ortasından yatay olarak bir delik açmak için 2 mm çapında bir matkap ucu kullanın (Ek Şekil S3A). Engelsiz bir delik oluşturmak üzere temizlemek ve pürüzsüzleştirmek için matkap ucunu delikten birkaç kez geçirin (Ek Şekil S3B). Bileşik dağıtım kanalının karşı tarafındaki plastisol halkasında dikey bir dilim oluşturun (Ek Şekil S3C). Halkayı tesisin etrafına yerleştirin ve dağıtım kanalını daha önce delinmiş delikle hizalayın (Ek Şekil S3D).NOT: Halka, sızıntıları önlemek için gövdenin etrafına sıkıca oturmalıdır; Farklı büyüklükteki bitki gövdeleri için plastisol halkalar yapmak için çeşitli çaplarda çekirdek tertibatları kullanılabilir. DPI cihazını plastisol halkasına ekleyerek birbirine sıkıca oturduğundan emin olun. DPI cihaz ağzını plastisol halka dağıtım kanalı ve delinmiş delik ile hizalayın (Ek Şekil S3E).NOT: Deliği ve DPI cihaz ağzını hizalamak için bir matkap ucu kullanmak yararlı olabilir. Aparatı yerinde tutmak için silikon bantla sıkıca sarın (Ek Şekil S3F). Tesis üzerinde uygun hizalama ve oryantasyonu sağlamak için tamamen monte edilmiş ve takılı cihazı kontrol edin. 6. DPI cihazını kullanarak ilgilenilen bileşiğin uygulanması DPI cihazını ilgilenilen çözelti ile doldurmak için bir şırınga veya pipet kullanın (Ek Şekil S3G). Havayı iç kanaldan dışarı çekmek ve hava kabarcıklarının bitki vaskülatürüne girmesini önlemek için DPI cihazının karşı tarafındaki silikon bant ve plastisol halkasına nüfuz etmek için bir şırınga kullanın (Ek Şekil S3H). Çıkarılan herhangi bir bileşiği DPI cihazına geri yerleştirin. Alanı güçlendirmek ve yırtılmaları önlemek için şırınga tarafından oluşturulan deliğin üzerine ek bir küçük silikon bant yaması ekleyin. Aparatı bağlantı noktasında gözle görülür sızıntılar açısından kontrol edin ve cihaz rezervuarında sabit bir sıvı seviyesi kontrolü yapın.NOT: Test çözeltisinin israfını önlemek için başlangıçta sızıntıları test etmek için su kullanılabilir. DPI cihazının açık ucunu balmumu sızdırmazlık filmi ile örtün ve bir conta oluşturmak ve deneysel bileşiğin buharlaşmasını azaltmak için aşağı çekin. Bir vakumun gelişmesini önlemek için balmumu filminde bir şırınga ucu ile tek bir delik açın ve daha sonra cihazı yeniden doldurun (Ek Şekil S3I). Bileşenlerin düzgün bir şekilde hizalandığından emin olmak için aparatı günlük olarak kontrol edin (Ek Şekil S3J) ve rezervuarın kurumasını önlemek için bir şırınga kullanarak sıvıyı doldurun. İstenilen miktarda deneysel çözelti sunulana kadar bu işlemi tekrarlayın.NOT: Bileşikler belirli bir cihazdan 1 aya kadar başarıyla verilebilir. Bu zaman dilimini aşan çözelti alım süreleri, deney kurulumundan önce ampirik olarak test edilmelidir. 7. Narenciye bitkileri ile vasküler hareketi gözlemlemek için CFDA kullanma DPI cihazını 25 cm boyundaki sitron (Citrus medica L.) tesislerine takın, DPI cihazınaH2O kontrolünde veya CFDA’da% 20 DMSO’nun tek bir 2,0 mL işlemini uygulayın ve 24 saat boyunca alımına izin verin. Bu protokolü takip etmek için, 2 mM ve% 20 DMSO’luk nihai bir CFDA konsantrasyonu üretmek için 400 μL CFDA stok çözeltisine 1,6 mLH2O ekleyerek (stok çözeltisi% 100 dimetil sülfoksit [DMSO] içinde çözünmüş 10 mM CFDA içerir) çalışan CFDA çözeltisini hazırlayın. Bitkinin çeşitli dokularının kesitlerini yapın ve bitki dokularındaki CFDA’yı görselleştirmek için 498 nm dalga boyunu içeren bir floresan filtreli bir stereoskop veya bileşik mikroskop kullanın. Dokudaki otofloresanı hesaba katmak için görüntüleriH2O kontrollerindeki% 20 DMSO ile karşılaştırın. 8. Streptomisin tedavisini takiben yaprak numunelerinde CLas titresindeki değişikliklerin ölçülmesi 0,75 m boyunda serada yetiştirilen CLas ile enfekte olmuş Valencia (Citrus sinensis (L.) Osbeck “Valencia”) bitkilerini kullanarak, her bitkiden iki HLB semptomatik yaprağının yaprak sapını ve midribini toplayın, küçük bölümlere ayırın, her doku tipini bir araya getirin ve 6,35 mm çapında çelik bir top içeren 2 mL darbeye dayanıklı numune tüplerinde ayrı ayrı saklayın. 3,4 m/s’de iki adet 15 s’lik döngü için programlanmış bir homojenizatör kullanarak numuneyi öğütün. Toplam nükleik asidi daha önce tarif edildiği gibi ekstrakte edin19. Tablo 1’de tanımlanan qPCR karışımını ve Tablo 2’de tanımlanan reaksiyon koşullarını kullanarak CLas ile enfekte olmuş yaprak numuneleri üzerinde qPCR gerçekleştirin. Daha fazla analiz için sağlam CLas enfeksiyonları gösteren bitkileri kullanın (sağlam enfeksiyon genellikle CLas 16S LasLong (LL) astar seti için qPCR tabanlı Ct değerleri < 30 olarak tanımlanır).NOT: Bakteriyel titre, daha önce20 açıklandığı gibi, göreceli genom eşdeğerlerini tahmin etmek için CLas 16S Las Long (LL) ve narenciye dehidrin DNA primerleri kullanılarak tahmin edilmektedir. Yukarıda özetlenen minimum enfeksiyon titresini karşılayan narenciye bitkilerini DPI cihazlarıyla donatın ve bunları istenen konsantrasyonda 2.0 mLH2O çözeltisi veya streptomisin çözeltisinin bir kerelik işlemine tabi tutun. Bu çalışmayı takip etmek için,H2O’daçözünmüş 9.5 mg / mL (toplamda 19 mg) streptomisinin tek bir 2.0 mL tedavisi kullanın. Yaprak örneklerini tedaviden 7 gün, 14 gün ve 28 gün sonra toplayın. Örneklenen yaprakları, yukarıda açıklandığı gibi aynı protokolü kullanarak CLas titresi için test edin. Tedaviden 60 gün sonra,H2O veya streptomisin ile muamele edilen bitkilerin fotoğraflarını alın. Enfeksiyon şiddetini puanlamak için CLas enfeksiyonunun görsel gözlemlerini kullanın. Hafif enfeksiyon belirtileri olarak yaprak yıkama büyümesi ile birlikte interveinal kloroz ve ven mantarı gösteren yaprakların% <50'sini ve interveinal kloroz ve ven mantarlaşması olan yaprakların% 50'sinden fazlasını ve ayrıca yaprak emilimini ve bitki büyümesinin bodurluğunu daha şiddetli enfeksiyonların belirtileri olarak arayın. 9. İmidakloprid tedavisini takiben D. citri’nin mortalitesinin ölçülmesi Yeni floş büyümesini teşvik etmek için 0,5 m boyundaki sitron (Citrus medica L.) bitkilerini 12 cm yüksekliğe kadar budayın.NOT: Yıkama büyümesinin hızı, bitki sağlığına ve yılın zamanına bağlı olabilir; Bu nedenle, deneysel tasarım sırasında bunu dikkate alın. 1-2 cm uzunluğunda >6 floş geliştikten sonra, bitkileri yetişkin D. citri içeren kafeslere sokun.Yumurtaların birikmesine izin vermek için bitkileri kafeslerde 24 saat bekletin. Döşemeden 1-2 gün sonra üç yıkama çekiminde temsili yumurta sayımı yapın ve ardından DPI cihazlarını uygulayın. Bu cihazları 2.0 mL su kontrolü veya istenen imidacloprid konsantrasyonu (% 21.8 aktif bileşen) ile doldurun. Bu protokolü takip etmek için 528 μL / L, 52.8 μL / L ve 5.28 μL / L imidakloprid kullanın.NOT: Yumurta sayımları yıkıcı bir önlemdir, bu nedenle bu aşamadaki sayımlar, aynı bitkinin sayılmamış floşundaki yumurta sayısını tahmin etmek için kullanılır ve deneyin sonunda yapılan sonraki nimf ortaya çıkma sayımları için bir temel oluşturmaya yardımcı olur. Kalan floş sürgünlerin en az üçünde D. citri ortaya çıkma oranını toplayın. Bileşik girişinden 7 gün sonra temsili bitki fotoğrafları alın.

Representative Results

Doğrudan infüzyon cihazı bileşenleriDoğrudan infüzyon cihazının taban versiyonu 8 cm boyunda ve ön ve yan tarafta 3,3 cm genişliğindedir (Şekil 1A). Ağızlıkla bitişik tek bir merkezi rezervuar içerir ve bu bileşenler içinde bulunabilecek toplam hacim 2,0 mL’dir (Şekil 1D). Plastisol halkası 1.8 cm boyunda ve 2.7 cm çapındadır (Şekil 1C). Bu halka ayrıca iki kanal içerir: biri DPI cihaz ağzını yerleştirmek için ve diğeri tedavi edilen ağacın gövdesine uyan değişken çaplı. Ek olarak, ağacı çevreleyen aşırı tedaviyi yönlendirmek için dikey kanalın etrafında bir oluk vardır, bu da kabuk boyunca ek bileşik alımına izin verir (Şekil 1F). Düzgün bir şekilde monte edildiğinde, plastisol halkası DPI cihazına karşı aynı hizada olmalı ve musluk ağaçta açılan delikle aynı hizada olmalıdır (Şekil 1B ve Şekil 1E). cesaretDPI cihazının narenciye bitkilerine eksojen kimyasallar sokma etkinliğini araştırmak için, cihaz kullanılarak 2.0 mL 2 mM CFDA’ya sızılmıştır. Tedavi edilen bitkinin vaskülatüründe bir floresan sinyali tespit edildi (Şekil 2A), ancakH2O’da DMSO ile muamele edilen kontrol tesislerinde yoktu (Şekil 2B). Bu sinyal, yaprak mezofil, yaprak sapı vaskülatürü, kök vaskülatürü ve kök vaskülatürü dahil olmak üzere disseke edilmiş tüm bitki dokusu tiplerinde gözlendi (Şekil 2C). Bu sinyal bitkide tedaviden sonraki 24 saat içinde gözlendi ve dokular boyunca nispeten eşit olarak dağıtıldı. StreptomisinTanıtılan bileşiklerin HLB hastalığı üzerinde terapötik bir etkisi olup olmadığını test etmek için, bakterisidal bir bileşik olan streptomisinin 2.0 mL’si, CLas-pozitif Valencia (Citrus sinensis) tatlı portakal bitkilerine 9.5 mg / mL (toplamda 19 mg) konsantrasyonda verildi. Bu bitkiler sera saksılarında tutuldu ve CLas titresi (narenciye genom eşdeğerleri başına CLas genom eşdeğerleri ile ölçüldü) qPCR kullanılarak zaman içinde izlendi (Şekil 3A). Streptomisin ve H2 O ile muamele edilmiş bitkiler için başlangıçtaki ortalama DNA CLas titreleri sırasıyla 0.562 CLas genomu / narenciye genomu ve 0.49 CLas genomu / narenciye genomu idi. Ortalama bakteri titresindeki azalmalar, streptomisin tedavisinden 7-28 gün sonra qPCR ile aynı zaman noktasındaH2Okontrolleri ile karşılaştırıldığında tespit edildi. Ek olarak, 0 ve gün 28 ortalama bakteri titreleri arasındaki fark, streptomisin ile muamele edilmiş bitkiler veH2O ile muamele edilmiş bitkiler için sırasıyla 0.314 ve 0.117 idi. Bu deney, bitkinin farklı zaman dilimlerinde farklı tedavilere tepkisini ölçmek için tasarlanmıştır. İki faktörlü ikinci dereceden yanıt yüzey tasarımı kullanıldı, zaman dört seviyeli (0 gün, 7 gün, 14 gün ve 28 gün) kantitatif bir ayrık faktör olarak ve iki seviyeli (H2O ve streptomisin) kategorik bir faktör olarak tedavi edildi. Sekiz tedavi kombinasyonunun her biri için beş replikat kullanıldı ve CLas titresi yanıt değişkeni olarak ölçüldü. Veriler, bir Box-Cox grafik analizine dayalı olarak log10 kullanılarak dönüştürülmüştür. Model azaltma, Akaike’nin bilgi kriteri (AICc)21 kullanılarak ileriye doğru seçim yapılarak gerçekleştirildi ve bu da hem zaman hem de etkileşim etkilerinin kaldırılmasıyla sonuçlandı. Geri kalan faktör, tedavi, anlamlıydı (p = 0.0252), streptomisin ile muamele edilmiş bitkiler, birleştirilen tüm zaman noktalarındaH2O ile muamele edilmiş bitkilerden (0.496) daha düşük bir ortalama CLas titresi (0.349) gösterdi (Şekil 3B). CLas titresindeki bu azalma, streptomisin ile muamele edilmiş bitkilerde 60 gün sonra yeni sağlıklı yıkama büyümesindeki ara sıra artışlara karşılık geldi,H2O (Şekil 3C) ile muamele edilen temsili ağaçların fotoğraflarıyla kanıtlandığı gibi, 19 mg streptomisin (Şekil 3D). ImidaclopridImidacloprid, D. citri insektisid tarama testi olarak potansiyelini test etmek için DPI cihazı kullanılarak genç Asya narenciye psyllid (ACP) istila edilmiş sitron bitkilerine tanıtıldı. Ticari bir imidacloprid insektisit çözeltisinin tek bir 2.0 mL arıtılması, bir su kontrolü ile birlikte üç farklı konsantrasyonda (5.28 μL / L, 52.8 μL / L ve 528 μL / L) test edilmiştir. İşlemden önce üç yıkama sürgün başına ortalama toplam yumurta sayısı 280.5 ila 321 arasında değişmekte olup, her bir tedavi grubu için kullanılacak bitkiler arasında anlamlı bir fark yoktu (Şekil 4A). Tedaviden 7 gün sonra üç floş sürgünde ortalama hayatta kalan toplam nimfler, su kontrolü için sırasıyla 293.75, 268, 97.5 ve 2 ve 5.28 μL / L, 52.8 μL / L ve 528 μL / L imidakloprid çözeltileri idi (Şekil 4B). Bu, tek yönlü bir ANOVA’ya göre su kontrolüne kıyasla 52.8 μL / L (p = 0.029) ve 528 μL / L (p = 0.002) imidacloprid çözelti seviyelerinde psyllid nimf ortaya çıkışında anlamlı bir azalmayı temsil ediyordu. Ek olarak, en yüksek imidakloprid çözelti seviyesindeki psyllid nimf mortalitesindeki bu artış, su kontrolüne kıyasla imidakloprid ile muamele edilmiş hatlarda (Şekil 4D) nimf bal çiği üretimindeki azalma ile görsel olarak belirgindi (Şekil 4D). Resim 1: Doğrudan bitki infüzyon cihazı ve plastisol halkası. (A) Bozulmamış doğrudan bitki infüzyon cihazı ve (C) boyutları ile birlikte plastisol halkası. (B) Doğrudan bitki infüzyon cihazı ve plastisol halkası bir narenciye ağacına bağlanır ve bağlanır. (D) doğrudan bitki infüzyon cihazının, (F) plastisol halkasının dikey kesitleri ve (E) bu iki bileşen bir narenciye ağacına bağlanır ve bağlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Resim 2: 25 cm’lik bir narenciye bitkisinin yaprak midribinin kesiti. Doğrudan bitki infüzyon cihazı kullanılarak (A) 2 mM CFDA veya (B)H2O’da DMSO ile tedaviden 24 saat sonra gösterilen görüntüler. (C) Doğrudan bitki infüzyon cihazının 5 cm yukarısındaki gövde (sol üstte), doğrudan bitki infüzyon cihazının 5 cm altındaki gövde (orta sol), kök (sol alt), yaprak midrib (sağ üst), yaprak sapı (orta sağ) ve yaprak mezofilini (sağ altta) içeren 2 mM CFDA işleminden 24 saat sonra çeşitli bitki dokularının kesitleri. Ölçek çubukları = 1 mm. Kısaltmalar: CFDA = 5,6-karboksifloresein-diasetat; DMSO = dimetil sülfoksit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: qPCR kullanarak zaman içinde CLas titresinin (narenciye genom eşdeğerleri başına CLas genom eşdeğerleri ile ölçülür) izlenmesi. (A) CLas DNA titresindeki değişiklikleri gösteren zaman seyri, 19 mg streptomisin ile muamele edilen beş bitkiyiH2O kontrolü ile muamele edilen beş bitki ile karşılaştırır. Noktalar, belirli bir zaman noktasında belirli bir tedavinin ortalamasını temsil eder. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder. (B)H2O ve streptomisin ile muamele edilmiş bitkilerin tüm zaman noktalarındaki ortalama CLas titresini gösteren çubuk grafik. Hata çubukları güven aralığını temsil eder ve yıldız işaretleri, tek yönlü bir ANOVA’ya göre streptomisin- veH2O ile muamele edilmiş bitkiler için ortalama CLas titreleri arasında önemli farklılıklar (* = p < 0.05) gösterir. (C) Narenciye bitkilerinin temsili görüntüleri: (C) H, 2, O veya (D) streptomisin ile doğrudan bitki infüzyonu tedavisinden 0 ay ve2ay sonra. Streptomisin ile muamele edilen bitkiler, 2 ay sonra yeni açık yeşil yaprak yıkama büyümesi gösterir, bu da CLas titresinde bir azalma olduğunu düşündürür. Kısaltma: CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Juvenil ACP ile enfekte olmuş sitron bitkilerinde psyllid nimf mortalitesinin izlenmesi. (A) tahmini ilk yumurta sayımlarını ve (B) üç narenciye üzerinde hayatta kalan D. citri perilerini gösteren çubuk grafikler, bir su kontrolü ve çeşitli imidakloprid seyreltmeleri ile tedaviden 7 gün sonra yıkanır. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder ve yıldız işaretleri, belirli bir arıtma seviyesi ile su kontrolü arasında tek yönlü bir ANOVA’ya göre önemli farklılıkları (* = p < 0.05, ** = p < 0.01) ve ardından bir Tukey'in post-hoc analizini gösterir. D. citri nimfleri tarafından istila edilmiş narenciye görüntüleri, doğrudan bitki infüzyon cihazı kullanılarak (C) su kontrolü veya (D) 528 μL / L imidacloprid ile tedaviden 7 gün sonra yıkanır. Kısaltmalar: ACP = Asya narenciye psyllid; D. citri = Diaphorina citri Kuwayama. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Numune başına hacim (μL) Parça 12.5 BRYT Yeşil Boya Master Mix ile 2x GoTaq qPCR 5 DNA Şablonu (20 ng/μL) 0.5 CLas için 10 μM Astar F ve R Clas: CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG (İleri);TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA (Ters) 0.5 Narenciye temizliği için 10 μM Astar F ve R Narenciye dehidrin: TGAGTACGAGCCGAGTGTTG (İleri);AAAACTTCACCGATCCACCAG (Ters) 6.5 H2O Tablo 1: Streptomisin ile muamele edilmiş narenciye hatlarındaki CLas titresini ölçmek için kullanılan qPCR karışımı. CLas DNA niceliği ve narenciye DNA nicelemesi için 16S Las Long primerlerinin ve narenciye dehidrin primerlerinin dizisi gösterilmiştir. Adım Sıcaklık (°C) Saat 1 İlk Denatüre 95 2 dk 2 Denatüre 95 15 saniye 3 Tavlama 60 20 saniye 4 Uzantı 72 20 saniye 5 2. Adıma Git ve 39x’i Tekrarla 6 Erime Eğrisi 0,2 °C/sn’de 95’e 60 rampa 3 dk Tablo 2: Streptomisin ile muamele edilmiş narenciye hatlarındaki CLas titresini ölçmek için kullanılan qPCR için reaksiyon koşulları. Ek Şekil S1: Plastisol halkasını oluşturmak için kalıbın montaj işlemini gösteren görüntüler. (A) Plastisol halka kalıbının ilk katmanını oluşturmak için birbirine geçmeli plastik bloklar kullanılmıştır. (B) Silikon RTV kauçuk, katalizör, gıda boyası ve sabun içeren homojen şekilde karıştırılmış çözelti. (C) Plastisol halka kalıbının ilk tabakası eşit şekilde dökülür. (D) Plastisol halka desenlerinin resmi, ortada tutma çekirdeği baskısı üstte. (E) Kalıbın kürlenmemiş ikinci tabakasına yerleştirilen plastisol halka desenleri. (F) İkinci katman kürlenirken desenleri sabitlemek için kullanılan maskeleme bandı ve kauçuk tokmak. (G) Kalıbın üçüncü katmanı, desenlerin üst kısmı ile aynı hizaya gelene kadar eklenir. (H) Kalıpların kalıptan çıkarılması. (I) Tamamen inşa edilmiş plastisol halka kalıbı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Şekil S2: Doğrudan bitki infüzyon cihazı ile ilişkili plastisol halkasının montaj işlemini gösteren görüntüler. (A) Kalıp, O-halkalı merkez çekirdek ve dağıtım kanalı çekirdeği dahil olmak üzere Plastisol halka montaj bileşenleri. (B) Sertleştirmeden sonra plastisol halkasının çıkarılmasını kolaylaştırmak için çekirdeklerin yapışmaz sprey pişirme yağı ile kaplanması. (C) Merkez çekirdeğin ve O-ringin kalıba sokulması. (D) Dağıtım kanalı çekirdeğinin merkez çekirdeğe dik olarak yerleştirilmesi. (E) Plastisol halkası çekirdek bileşenlerinin kalıp boşluğuna uygun şekilde monte edilmesi. (F) Plastisol halkasının oluşturulması için kullanılan plastisol. (G) Plastisolün mikrodalgada ısıtılması. (H) Isıtmadan sonra plastisolün karıştırılması. (I) Plastisol sıcaklığının kontrol edilmesi. (J) Isıtılmış plastisolün monte edilmiş çekirdeğe dökülmesi. (K) Plastisolün monte edilmiş çekirdeğin etrafında soğutulmasına izin vermek. (L) Doğrudan bitki infüzyon cihazına bağlı tamamen monte edilmiş plastisol halkaları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Şekil S3: Doğrudan bitki infüzyon cihazının montaj işlemini gösteren görüntüler. (A) Bileşik dağıtımı için bir kanal oluşturmak üzere narenciye tesisinin ortasından bir delik açmak. (B) Delinen deliğin önden görünümü. (C) Bileşik dağıtım kanalının karşısında bir tıraş bıçağı ile plastisol halkanın dilimlenmesi. (D) Plastisol halkasının daha önce delinmiş deliğin bulunduğu yerdeki sapın etrafına sıkıca takılması. (E) Doğrudan bitki infüzyon cihazının plastisol halkasına takılması, cihaz üzerindeki bileşik dağıtım spigotunun plastisol halkasının kanalına yerleştirilmesi. (F) Doğrudan bitki infüzyon cihazını plastisol halkasına sabitlemek ve tüm aparatı yerinde tutmak için silikon bant kullanmak. (G) Doğrudan bitki infüzyon cihazı odasının ilgili bileşikle doldurulması. (H) Tesisteki delinmiş delikten hava çekmek ve bileşiğin akışını başlatmak için bir şırınga kullanmak. (I) Doğrudan bitki infüzyon cihazı odasındaki açıklığa balmumu sızdırmazlık filmi uygulamak ve vakumu önlemek için bir delik açmak. (J) Narenciye bitkisi üzerinde tamamen monte edilmiş doğrudan bitki infüzyon cihazı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 1: Plastisol halka merkezi post çekirdeği . 4 mm’lik bir ağaç için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 2: Plastisol halka merkezi post çekirdeği . 6 mm’lik bir ağaç için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 3: Plastisol halka merkezi post çekirdeği . 8 mm’lik bir ağaç için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 4: Plastisol halka merkezi post çekirdeği . 10 mm’lik bir ağaç için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 5: Plastisol halka merkezi post çekirdeği. 12 mm’lik bir ağaç için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 6: Plastisol halka merkezi post çekirdeği. 14 mm’lik bir ağaç için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 7: Plastisol halka dağıtım kanalı çekirdeği. 4 mm’lik bir ağaç için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 8: Plastisol halka dağıtım kanalı çekirdeği. 6 mm’lik bir ağaç için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 9: Plastisol halka dağıtım kanalı çekirdeği. 8 mm’lik bir ağaç için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 10: Plastisol halka dağıtım kanalı çekirdeği. 10 mm’lik bir ağaç için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 11: Plastisol halka dağıtım kanalı çekirdeği. 12 mm’lik bir ağaç için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 12: Plastisol halka dağıtım kanalı çekirdeği. 14 mm’lik bir ağaç için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 13: Doğrudan bitki infüzyon cihazı. STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 14: Plastisol halkası için kalıp oluşturmak için kullanılan desen. STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

DPI cihazının bitkilere eksojen bileşik dağıtımı için uygun bir yöntem olarak kabul edilmesi için, çeşitli doku tiplerine sağlam ve tutarlı bileşik alımına katkıda bulunması gerekir. CFDA’yı kullanan deney, hem akropetal hem de bazipetal bileşik hareketinin yanı sıra yaprağın hem vasküler sisteminde hem de mezofil hücrelerinde açıkça göstermiştir. Ek olarak ve muhtemelen bu DPI cihazında kullanılan sıkılmış delik, bileşik alımı için büyük miktarda yüzey alanı sağladığından, CFDA, gövde enjeksiyonukullanan bitkilerde önceki boya alım çalışmalarında görüldüğü gibi, sadece cihaza bitişik vaskülatürün küçük bir alt kümesinde değil, gövdenin tüm bölümlerinde nispeten eşit miktarlarda mevcuttu 6. Ek olarak, yeşil floresan proteini ve çiçek boyasının verilmesi DPI cihazı kullanılarak test edildi ve bu bileşiklerin CFDA’ya benzer bir dağılımı gözlendi (veriler gösterilmedi). Bu veriler, cihazın sistematik olarak boyut ve moleküler yapıya göre değişen çeşitli bileşikler sunmak için kullanılabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, yaprak gelişim aşamasına bağlı olarak bileşik alımında farklılıklar olduğunu, genç gelişmekte olan yaprakların yaşlı yerleşik yapraklardan daha fazla bileşik aldığını belirtmek gerekir. Bu, kaynak dokuya karşı lavaboda bulunan vaskülatür özelliklerindeki değişikliklerden kaynaklanabilir ve belirli bir deney için optimize edilmelidir.

DPI cihazı, CFDA, GFP ve çiçek boyasının görselleştirilmesi için yeterli bileşik alımı gösterdi ve ayrıca sırasıyla streptomisin ve imidaklopridin antibakteriyel ve böcek öldürücü etkilerini göstermek için yeterli sürdü. Her iki bileşik de tek bir 2.0 mL tedaviden 1 hafta sonra hedef organizma canlılığında değişikliklere neden oldu. Bu veriler, DPI cihazının, mikrobiyal ve böcek zararlılarının kontrolü için çok çeşitli bileşiklerin yaşayabilirliğini test etmek için tüm bitki tahlillerinde kullanılabileceğini göstermektedir. Dahası, vasküler sistemle doğrudan teması nedeniyle, bu cihaz kökler veya epidermal hücreler tarafından verimli bir şekilde alınmayan bileşikleri test etmek için bir fırsat bile sağlayabilir. Özellikle ilgi çekici olan RNA girişimi (RNAi) olacaktır, çünkü bu, konakçı bitki, patojen veya patojen vektörü içindeki gen ekspresyonunu modüle etmek için kullanılabilir. Saç tokası RNA’sını elma ve üzüm bitkilerinin gövdesindeki delinmiş bir delikten geçiren önceki araştırmalar, RNA moleküllerinin ksilem dokusuyla sınırlı olduğunu gösterdi ve bu moleküllerin sadece çiğneme ve ksilem özsuyu besleyen organizmalara karşı etkili olabileceğini düşündürdü22. DPI cihazının benzer bir delinmiş delik dağıtım sistemi kullandığı göz önüne alındığında, bu cihazla birlikte verilen saç tokası RNA’sının da ksilem dokusuyla sınırlı olabileceği düşünülmektedir. Bununla birlikte, DPI cihazından streptomisin tedavisinden sonra floem sınırlı CLas titresinde gözlenen azalma, bu antibiyotiğin floemde mevcut olduğunu kuvvetle düşündürmektedir. Bu nedenle, DPI cihazı kullanılarak verilen bileşiklerin vasküler dağılımının boyutlarına ve kimyalarına bağlı olması muhtemeldir ve her molekül ayrı ayrı değerlendirilmelidir.

Piyasada piyasada satılan bir dizi DPI cihazı olmasına rağmen, burada açıklanan cihaz şirket içinde üretilebilir ve değiştirilebilir. Bu şekilde, kullanılan bitki türüne ve deneysel tasarıma göre iyileştirmeler ve büyüklükte değişiklikler yapılabilir ve ticari ürünlere bağlı değildir. Ek olarak, cihaz bitkiye yarı kalıcı olarak bağlanır, yani belirli bir bileşiğin çoklu işlemleri, bitkiyi birden fazla bileşik enjeksiyonu ile yeniden yaralamak zorunda kalmadan aynı anda gerçekleştirilebilir. Uyarı notunda, cihaz düzgün takılmazsa sızıntı yapabilir. Sonuç olarak, bileşik bitkiye teslim edilmek yerine çevreye kaybolur. Bu nedenle, kurulum sırasında ve sonraki ilk birkaç gün boyunca cihazı herhangi bir sızıntı belirtisi açısından kontrol etmeye özen gösterilmelidir. Ağaçta bir delik açmak potansiyel olarak zararlı olsa da, bu yöntem sağlam ve tutarlı bileşik alımını sağlamak için seçilmiştir. Ek olarak, bu deneylerde DPI cihazının takılmasından bitki sağlığı üzerinde olumsuz bir etki görülmemiştir. Bununla birlikte, belirli bir deney boyunca canlılığını kaybedebilecek olanların yerini almak için deneysel tasarıma ekstra bitkiler dahil edilmelidir. Son olarak, bu cihaz bileşikleri tanıtmak için pasif akış kullandığından, farklı bitki türleri veya aynı türün gelişim aşamaları arasındaki alım oranını tahmin etmek zor olabilir. Bu, bileşik alımının hızı sınırlayıcı bir faktörse deneyleri karmaşıklaştırabilir. En iyi sonuçlar için, deneyler, bitkinin 1 haftaya kadar sürebilen 2.5 mL bileşiği tamamen emmesi için yeterli zaman sağlanacak şekilde planlanmalıdır. Sonuç olarak, bu DPI cihazı, antimikrobiyal veya insektisidal bileşiklerin in planta aktivitesinin CLas ve vektörü D. citri’ye karşı hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için etkili bir araçtır, böylece sistemik etkinlik ve bitki performansı üzerindeki etkisi hakkında daha önce sunulan müstakil yaprak tahlili23’ten daha fazla bilgi sağlar. Kuşkusuz, bu sistem için uygulama çeşitliliği, bu çalışmada açıklanan özel kullanımların çok ötesine ulaşmaktadır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar bu çalışmada kullanılan bitkiler için Mant Acon’a teşekkür eder. Finansman, ABD Tarım Bakanlığı (USDA) CRIS projesi 8062-22410-007-000-D ve USDA NIFA hibesi 2020-70029-33176 tarafından sağlandı.

Materials

0.5 cm Diameter Steel Balls Ballistic Products Inc. #SHT #T
10 mL Luer-Lok Syringe Becton Dickinson 382903029952
20 G 1 Syringe Needle Becton Dickinson 305175
2 mL Screw Cap Tubes USA Scientific 1420-9710
3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit Sears 964077
3D Printer Markforged F-PR-2027
3D Printing Software Markforged F-SW-FDVX
3D Printing Software Markforged S-FW-OEVX
5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) Invitrogen C195
5/64th Inch Black Oxide Drill Bit Sears 964502
96 Well qPCR Machine Roche 5815916001
Centrifuge Eppendorf 22621408
Fluorescent Microscope Olympus SP-BX43-BI
Fluorescent Microscope Filter Chroma 69401-ET
Gloss Clear Spray Paint Rustoleum 249117
Grey Lego Baseplate Lego 11024
Handheld Cordless Drill Makita 6349D
Homogenizer Fisher Scientific 15-340-163
Imidacloprid 2F Quali-Pro 83080133
Liquid Plastisol Medium Hardness Fusion X Fishing Lures XSOL-505
Red Silicone 70 Shore A O-Ring Grainger Varies by Size
Non-Stick Cooking Spray PAM 64144030217
NucleoSpin Plant II Macherey-Nagel 740770.5
Parafilm Bemis HS234526A
Poly Viyl Acetate Based Glue Elmers E301
qPCR Master Mix Promega A6001
qPCR Primers Integrated DNA Technologies Varies by DNA sequence
Reverse Transcriptase Promega A5003
Single Edge Razor Blade Garvey 40475
Translucent Silicone RTV Rubber Aero Marine Products AM 115T
Transparent Silicone Tape Maxwell KE30S
Truncated Oncocin 112 Genscript Varies by peptide sequence
White 1 x 6 Lego Piece Lego 300901
White Nylon Markforged F-MF-0003
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, J., Wang, N. Evaluation of the spatiotemporal dynamics of oxytetracycline and its control effect against citrus huanglongbing via trunk injection. Phytopathology. 106 (12), 1495-1503 (2016).
  2. Bendix, C., Lewis, J. D. The enemy within: Phloem-limited pathogens. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 238-254 (2018).
  3. Keshavareddy, G., Kumar, A. R. V., Ramu, V. S. Methods of plant transformation- A review. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (7), 2656-2668 (2018).
  4. Qaim, M. Role of new plant breeding technologies for food security and sustainable agricultural development. Applied Economics Perspectives and Policy. 42 (2), 129-150 (2020).
  5. Siegrist, M., Hartmann, C. Consumer acceptance of novel food technologies. Nature Food. 1 (6), 343-350 (2020).
  6. Larson, D. W., Doubt, J., Matthes-Sears, U. Radially sectored hydraulic pathways in the xylem of Thuja occidentalis as revealed by the use of dyes. International Journal of Plant Sciences. 155 (5), 569-582 (1994).
  7. Mehdi, R., et al. Symplasmic phloem unloading and radial post-phloem transport via vascular rays in tuberous roots of Manihot esculenta. Journal of Experimental Botany. 70 (20), 5559-5573 (2019).
  8. Miller, G. S., Parente, R. M., Santra, S., Gesquiere, A. J. Tracking of fluorescent antibiotic conjugate in planta utilizing fluorescence lifetime imaging. Planta. 253 (2), (2021).
  9. Treydte, K., Lehmann, M. M., Wyczesany, T., Pfautsch, S. Radial and axial water movement in adult trees recorded by stable isotope tracing. Tree Physiology. 41 (12), 2248-2261 (2021).
  10. Nie, P. Liping Hu, Haiyan Zhang, Jixiang Zhang, Zhenxian Zhang, Lingyun Zhang, The predominance of the apoplasmic phloem-unloading pathway is interrupted by a symplasmic pathway during Chinese jujube fruit development. Plant and Cell Physiology. 51 (6), 1007-1018 (2010).
  11. Jiang, M., Deng, Z., White, R. G., Jin, T., Liang, D. Shootward movement of CFDA tracer loaded in the bottom sink tissues of Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59606 (2019).
  12. Liu, H., Si, C., Shi, C., Wang, S. Zhe Sun, Yanxi Shi, from apoplasmic to symplasmic phloem unloading during storage roots formation and bulking of sweet potato. Crop Science. 59 (2), 675-683 (2019).
  13. Erdos, T., Ullmann, A. Effect of streptomycin on the incorporation of amino-acids labeled with carbon-14 into ribonucleic acid and protein in a cell-free system of a Mycobacterium. Nature. 183 (4661), 618-619 (1959).
  14. Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
  15. Motaung, T. E. Chloronicotinyl insecticide imidacloprid: Agricultural relevance, pitfalls and emerging opportunities. Crop Protection. 131, 105097 (2020).
  16. Berger, C., Laurent, F. Trunk injection of plant protection products to protect trees from pests and diseases. Crop Protection. 124, 104831 (2019).
  17. Archer, L., Crane, J. H., Albrecht, U. Trunk injection as a tool to deliver plant protection materials-An overview of basic principles and practical considerations. Horticulturae. 6 (6), 552 (2022).
  18. Wise, J. C., et al. Trunk injection: A discriminating delivering system for horticulture crop IPM. Entomology, Ornithology & Herpetology: Current Research. 03 (2), (2014).
  19. Ammar, E. D., George, J., Sturgeon, K., Stelinski, L. L., Shatters, R. G. Asian citrus psyllid adults inoculate Huanglongbing bacterium more efficiently than nymphs when this bacterium is acquired by early instar nymphs. Scientific Reports. 10 (1), 18244 (2020).
  20. Stover, E., Mccollum, G., Ramos, J., Shatters, R. G. Growth, health and Liberibacter asiaticus titer in diverse citrus scions on mandarin versus trifoliate hybrid rootstocks in a field planting with severe Huanglongbing. Proceedings of the Florida State Horticultural Society. 127, 53-59 (2014).
  21. Akaike, H. A new look at the statistical model identification. IEEE Transactions on Automatic Control. 19 (6), 716-723 (1974).
  22. Dalakouras, A., Jarausch, W., Buchholz, G., Bassler, A., Braun, M., Manthey, T., Krczal, G., Wassenegger, M. Delivery of hairpin RNAs and small RNAs into woods and herbaceous plants by trunk injection and petiole absorption. Frontiers in Plant Science. 9, 1253 (2018).
  23. Ammar, E. D., Walter, A. J., Hall, D. G. New excised-leaf assay method to test inoculativity of Asian citrus psyllid (Hemiptera: Psyllidae) with Candidatus Liberibacter asiaticus associated with citrus Huanglongbing disease. Journal of Economic Entomology. 106 (1), 25-35 (2013).

Tags

Direct Plant InfusionMolecule DeliveryCandidatus Liberibacter AsiaticusCLas3D-printed DevicePhloemPlant TranspirationTherapeutic Compound ScreeningHuanglongbingDiaphorina CitriStreptomycinCitrus Plants

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rhodes, B. H., Stange, R. R., Zagorski, P., Hentz, M. G., Niedz, R. P., Shatters, R. G., Pitino, M. Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants. J. Vis. Exp. (196), e65194, doi:10.3791/65194 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image