JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

Published: May 19, 2023
doi:
10.3791/65184
, , ,
1Program in Molecular Medicine,University of Massachusetts Chan Medical School, 2Cancer Center,University of Massachusetts Chan Medical School

Summary

Aquí, presentamos una compilación de ensayos para medir directamente la función mitocondrial en células de mamíferos independientemente de su capacidad para consumir oxígeno molecular.

Abstract

El flujo de electrones en la cadena de transporte de electrones mitocondrial (ETC) apoya funciones biosintéticas, bioenergéticas y de señalización multifacéticas en células de mamíferos. Como el oxígeno (O2) es el aceptor terminal de electrones más ubicuo para el CTE de mamíferos, la tasa de consumo deO2 se usa con frecuencia como un proxy para la función mitocondrial. Sin embargo, la investigación emergente demuestra que este parámetro no siempre es indicativo de la función mitocondrial, ya que el fumarato puede emplearse como un aceptor de electrones alternativo para mantener las funciones mitocondriales en la hipoxia. Este artículo recopila una serie de protocolos que permiten a los investigadores medir la función mitocondrial independientemente de la tasa de consumo deO2. Estos ensayos son particularmente útiles cuando se estudia la función mitocondrial en ambientes hipóxicos. Específicamente, describimos métodos para medir la producción de ATP mitocondrial, la biosíntesis de novo pirimidina, la oxidación de NADH por el complejo I y la producción de superóxido. En combinación con experimentos clásicos de respirometría , estos ensayos ortogonales y económicos proporcionarán a los investigadores una evaluación más completa de la función mitocondrial en su sistema de interés.

Introduction

La función mitocondrial es una métrica crítica de la salud celular, ya que sostiene funciones biosintéticas, bioenergéticas y de señalización clave en células de mamíferos1. La gran mayoría de las funciones mitocondriales requieren flujo de electrones a través de la cadena de transporte de electrones (ETC), y las interrupciones en el flujo de electrones en el ETC causan enfermedad mitocondrial grave2. El ETC se compone de una serie de reacciones de reducción y oxidación (redox) que están incrustadas en la membrana mitocondrial interna, y estas reacciones de transferencia de electrones liberan energía libre que puede aprovecharse para apoyar la síntesis de ATP, procesos fisiológicos como la termogénesis, vías biosintéticas como la biosíntesis de novo pirimidina y el equilibrio del estado redox de cofactores como NADH. Los complejos ETC I y III producen especies reactivas de oxígeno (ROS)3,4,5, que, a su vez, regulan vías clave de señalización como HIF, PI3K, NRF2, NFκB y MAPK 6. En consecuencia, las métricas del flujo de electrones en el ETC se utilizan clásicamente como un proxy para la función mitocondrial en las células de mamíferos.

Los experimentos de respirometría se emplean con frecuencia para medir la función mitocondrial en células de mamíferos. Dado que elO2 es el aceptor terminal de electrones más ubicuo para el ETC de mamíferos, su reducción se utiliza como un proxy para la función mitocondrial. Sin embargo, la evidencia emergente demuestra que las mitocondrias de mamíferos pueden emplear fumarato como aceptor de electrones para mantener las funciones mitocondriales que dependen del CTE, incluida la biosíntesis de pirimidina de novo 7, la oxidaciónde NADH7 y la desintoxicación del sulfuro de hidrógeno8. Por lo tanto, en ciertos contextos, especialmente en ambientes hipóxicos, las mediciones de la tasa de consumo deO2 (OCR) no proporcionan una indicación precisa o exacta de la función mitocondrial.

Aquí, describimos una serie de ensayos que se pueden emplear para medir la función mitocondrial independientemente del OCR. Proporcionamos ensayos para medir directamente la oxidación compleja de NADH mediada por I, la biosíntesis de novo pirimidina mediada por dihidroorotato deshidrogenasa, la síntesis de ATP dependiente del complejo V, la direccionalidad neta del complejo succinato deshidrogenasa (SDH) y las ROS derivadas de mitocondrias. Estos ensayos están destinados a realizarse en células de mamíferos cultivadas, aunque muchos pueden adaptarse para estudiar las funciones mitocondriales in vivo. En particular, los ensayos descritos en este protocolo son mediciones más directas de las funciones mitocondriales que el OCR. Además, permiten la medición de la función mitocondrial en hipoxia, un contexto en el que el OCR no es una medida indicativa. Tomados en conjunto, estos ensayos, en combinación con experimentos clásicos de respirometría, proporcionarán a los investigadores una evaluación más completa de la función mitocondrial en células de mamíferos.

Protocol

1. Ensayos de proliferación para medir la actividad del complejo I, la dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH) y las actividades del complejo V Células de siembra para ensayos de proliferaciónNOTA: Este protocolo utiliza la línea celular de osteosarcoma humano 143B comprada comercialmente a ATCC. Esta línea celular se utilizó bajo las directrices de nuestro protocolo aprobado del Comité Institucional de Bioseguridad (IBC).Retire las placas de la incubadora de cultivo de tejidos. Aspire el medio de las placas y lávese con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar cualquier medio sobrante. Aspire el PBS y cubra el plato con tripsina al 0,05% -0,25% para levantar las células del fondo del plato. Espere 3-5 minutos para que la tripsina libere las células de la placa, y luego apague la tripsina con 10 ml del medio de crecimiento deseado que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS). Recoger las células en un tubo cónico, y centrifugar a 1.000 × g durante 5 minutos para granular las células. Aspirar el medio del tubo sin alterar el pellet. Vuelva a suspender el pellet con el medio completo. Cuente las células y cuantifique el volumen necesario para sembrar entre 10,000 y 25,000 células en una placa de 6 pocillos.NOTA: Cada línea celular deberá optimizarse para el número de celdas que se van a sembrar. La confluencia ideal lograda es ~10% al comienzo del experimento y ~80% al final del experimento. Pipetear las células en una placa de 6 pocillos y añadir 2 ml de medio completo a los pocillos. Dejar reposar durante 24 h antes de cambiar a las condiciones del medio experimental.NOTA: Siembre al menos tres réplicas por condición y suficientes pocillos para probar la condición de control no tratada, la condición de control tratada con inhibidor, la condición experimental no tratada y la condición experimental tratada con inhibidores. Cambio medio para evaluar la actividad V compleja por proliferaciónNOTA: Las células que proliferan en un medio con galactosa dependen de la actividad del complejo V para la síntesis de ATP 9,10. A diferencia de la glucosa, que produce dos ATP netos de la glucólisis, la galactosa no produce ninguno, lo que obliga a las células a depender del complejo V para la síntesis de ATP (Figura 1). El inhibidor del complejo V oligomicina se utiliza como control.Producir 10 mM de medio que contenga glucosa (ver Tabla 1). Producir 10 mM de medio que contenga galactosa (ver Tabla 1). Cambie el medio en cada pocillo a DMEM que contenga glucosa o DMEM que contenga galactosa. Agregue oligomicina 5 μM (el inhibidor del complejo V) a los pocillos relevantes y el mismo volumen de DMSO a los pocillos no tratados. La reserva de oligomicina es de 10 mM resuspendida en DMSO. Vuelva a colocar la placa en la incubadora de cultivo de tejidos durante 2 días. Cambio medio para evaluar la actividad compleja I por proliferaciónNOTA: Las células que proliferan en un medio libre de piruvato son más dependientes de la actividad del complejo I11,12. Sin piruvato, las células cultivadas requieren el complejo I para facilitar la mayor parte de la reoxidación de NADH a NAD + (Figura 2). El inhibidor del complejo I rotenona se utiliza como control.Haga un medio DMEM libre de piruvato suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Hacer una solución de piruvato de 1 M (ver Tabla 1). Cambie el medio en cada pocillo a medio libre de piruvato o medio que contenga piruvato. Agregue 2 μM de rotenona (el inhibidor del complejo I) a los pocillos tratados y el mismo volumen de DMSO a los pocillos no tratados. El stock de rotenona es de 25 mM resuspendido en DMSO. Vuelva a colocar la placa en la incubadora de cultivo de tejidos durante 2 días. Cambio medio para evaluar la actividad de DHODH por proliferaciónNOTA: Las células que proliferan en un medio libre de uridina requieren actividad dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH)11,12,13. En ausencia de uridina exógena, las células cultivadas sintetizan pirimidinas a través de la vía de novo. El inhibidor de DHODH brequinar se utiliza como control.Haga DMEM sin uridina suplementado con 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Preparar una solución madre de uridina de 10 mg/ml y luego preparar un medio de uridina de 100 μg/ml (ver Tabla 1). Cambie el medio en cada pocillo a medio libre de uridina o medio que contenga uridina. Añadir 5 μM de brequinar (el inhibidor de DHODH) a los pocillos tratados y el mismo volumen de DMSO a los pocillos no tratados. El stock de brequinar es de 10 mM resuspendido en DMSO. Vuelva a colocar la placa en la incubadora de cultivo de tejidos durante 2 días. Contar las células para ensayos de proliferaciónPara todos los experimentos, reponga el medio cada 2 días. Si el medio se vuelve de color amarillo, aumente la frecuencia de los cambios del medio. Permita que las células proliferen hasta por 7 días y detenga el experimento si alguno de los pozos comienza a verse demasiado crecido. Los pozos se consideran cubiertos de maleza cuando la confluencia supera el 80%. Aspirar el medio, lavar con 1x PBS y cubrir el fondo del pocillo con tripsina al 0,25% (500 μL para un plato de 6 pocillos). Espere 5 minutos hasta que las células se hayan levantado del plato. Verifique esto bajo un microscopio. Apague la tripsina con 1 ml de DMEM completo que contenga 10% de FBS. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para separar los grupos de células. Prepare las tazas de contador Coulter llenando cada una con 10 ml de tampón isotono (una taza por pocillo). Cuente las celdas en un contador de celdas y registre los datos. Si la lectura es de células por mililitro (células/ml), multiplique el valor registrado por 1,5 para obtener el número total de células por pocillo.NOTA: Otros métodos de conteo celular, como un hemocitómetro, serán suficientes si el laboratorio no tiene un contador Coulter. 2. Rastreode isótopos estables13 C 4-aspartato y análisis LC-MS para medir la actividad de DHODH 13Rastreo de isótopos establesde C 4-aspartato en células adherentesNOTA: La actividad de DHODH se puede monitorear directamente midiendo la incorporación de 13 C 4-aspartato en 13C3-UMP. Brequinar se utiliza como control de la actividad de la DHODH (Figura 3). Los niveles resultantes de 13C3-UMP son una medida de la actividad de DHODH.Siembra entre 250.000 y 500.000 células en una placa de 6 pocillos para lograr una confluencia del 75% al día siguiente. Preparar una solución madre de 250 mM 13 C 4-aspartato y 10 mM 13C4-aspartato medio (ver Tabla 1). Cambie el medio en cada pocillo a un medio que contenga 10 mM 13C 4-aspartato. Incubar durante el número apropiado de horas para lograr un estado estacionario para etiquetar las celdas de interés.NOTA: El estado estacionario se define como el marco de tiempo en el que el porcentaje de metabolitos marcados se estabiliza a lo largo del tiempo14. Para las células de osteosarcoma 143B, 13C 4-aspartato alcanza un estado estacionario en 8 h. Es una buena práctica determinar este marco de tiempo antes de la experimentación haciendo un experimento de curso de tiempo con el isótopo estable de interés. Aislamiento de metabolitos de las células adherentesAntes de comenzar, prepare un cubo de hielo seco y prepare MeOH de grado HPLC al 80% en agua de grado HPLC. Enfríe este tampón en un congelador de -80 °C durante la noche o colóquelo directamente sobre hielo seco. Sacar un plato a la vez de la incubadora, aspirar el medio de los pozos y lavar 2x con 1x PBS. Retire todo el PBS residual de los pozos antes de pasar al siguiente paso.NOTA: Asegúrese de inclinar el plato durante la aspiración y pipetear contra la pared del plato para evitar la interrupción de las células adherentes. Coloque la placa en hielo seco e inmediatamente agregue 800 μL de MeOH de grado LCMS al 80% en agua de grado LCMS al 20% a cada pozo. Incubar la placa durante al menos 15 minutos en un congelador de -80 °C para facilitar la lisis celular.NOTA: En este punto, se puede sacar la siguiente placa de la incubadora y repetir los pasos 2.2.1-2.2.4. Continúe hasta que todas las placas se incuben en el congelador de −80 °C. Sacando un plato a la vez del congelador, raspe cada pozo en hielo seco con un elevador de células y transfiera el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mantenga el tubo en hielo seco hasta el siguiente paso. Vortex todos los tubos durante 10 min a 4 °C, y luego centrifugar a 4 °C durante 10 min a velocidad máxima (al menos 17.000 × g). Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y séquelo en un concentrador de vacío de 4 °C equipado con una trampa fría de -105 °C en un ajuste de alto vacío durante aproximadamente 6 h o hasta que las muestras se hayan evaporado. Una vez que el lisado se haya secado, almacene los gránulos de metabolitos a -80 °C hasta que estén listos para prepararlos para la cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas (LCMS). Medición de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) de metabolitos polaresNOTA: Cualquier flujo de trabajo cromatográfico y de espectrometría de masas que permita la detección de aspartato, los intermedios en la biosíntesis de novo pirimidina y UMP será suficiente14.Preparar las muestras para LCMS en hielo añadiendo 100 μL de agua de grado HPLC a los gránulos secos y vórtice durante 10 min a 4 °C. Centrifugar las muestras a 4 °C durante 10 min a velocidad máxima (al menos 17.000 × g) y mover 25 μL a cada vial de LC-MS. Inyectar 2 μL de lisado en el sistema LC-MS. A continuación se presenta una metodología comúnmente utilizada:Preparar la fase A móvil que comprende 20 mM de carbonato de amonio (grado LC-MS) e hidróxido de amonio al 0,1% (grado LC-MS) disuelto en agua de grado LC-MS. Elija 100% acetonitrilo (grado LC-MS) como fase B móvil. Para la cromatografía, elija una columna analítica de 5 μm, 150 mm x 2,1 mm equipada con una columna de protección de 2,1 mm x 20 mm para compuestos hidrófilos (consulte la Tabla de materiales). Ajuste el horno de columna a 25 °C. Utilice los siguientes ajustes de cromatografía líquida: un caudal constante de 0,15 ml/min; un gradiente lineal del 80% al 20% de la fase móvil B durante 20 min, seguido de un gradiente lineal del 20% al 80% de la fase móvil B durante 0,5 min, seguido de una retención al 80% de la fase móvil B durante 7,5 min. Elija los siguientes ajustes del espectrómetro de masas: un escaneo completo entre m/z 70 Da y 1.000 Da; una resolución de 70.000; un objetivo AGC de 1 × 106; y un tiempo máximo de inyección de 20 ms. Opere la fuente en modo de conmutación de polaridad. Ajuste el voltaje de pulverización a 3.0 kV, el capilar calentado a 275 °C, la sonda HESI a 350 °C, el flujo de gas de la vaina a 40 unidades, el flujo de gas auxiliar a 15 unidades y el flujo de gas de barrido a 1 unidad. Realice el análisis de datos utilizando cualquier software que interactúe con el flujo de trabajo LCMS.NOTA: El software utilizado con el flujo de trabajo anterior es XCalibur (Thermo) y TraceFinder (Thermo). Las consideraciones clave para el análisis de datos se describen a continuación:Tiempos de retención esperados: Determinar el tiempo de retención de cada metabolito ejecutando los patrones para cada metabolito de interés utilizando el método cromatográfico antes del experimento.NOTA: Los tiempos de retención de UMP y sus isótopologos, incluyendo 13C3-UMP, son exactamente los mismos. M/Z esperado para metabolitos: Si un metabolito se ioniza en el modo de iones negativos (como UMP), calcule la masa exacta esperada utilizando la fórmula molecular de UMP menos un protón [C 9 H14N2O9P]. Para los metabolitos que se ionizan en modo de iones positivos, calcule la masa exacta utilizando la fórmula molecular más un protón. Precisión de masa: Cuando se utiliza un espectrómetro de masas orbitrap, se espera que el metabolito de interés y sus isótopologos tengan una precisión de masa ±5 mmu. Utilice software para calcular esto, teniendo en cuenta el M/Z esperado y el M/Z real detectado. Corrección de abundancia natural: Se espera que todos los datos de rastreo se sometan a una corrección de abundancia natural para tener en cuenta los isótopos ~ 1% 13C y ~ 0.5% 15 N en la naturaleza 15. 3. Rastreode isótopos establesde 5-glutamina 13 C para medir la actividad de SDH 13Rastreo de isótopos estables de C5-glutamina en células adherentesNOTA: La actividad de SDH puede ser monitoreada directamente midiendo la interconversión de ciertos isotopólogos de fumarato y succinato en el rastreo de 13C5-glutamina 7,16,17. El inhibidor del complejo III antimicina se utiliza como control para alterar la direccionalidad neta del complejo SDH (Figura 4).Siembra entre 250.000 y 500.000 células en una placa de 6 pocillos para lograr una confluencia del 75% al día siguiente. Preparar una reserva de 50 mM 13C 5-glutamina (ver Tabla 1). Preparar un medio de trazado que contenga 2 mM 13C5-glutamina (ver Tabla 1). Cambie el medio en cada pocillo a un medio que contenga 2 mM 13C5-glutamina. Incubar durante el número adecuado de horas para lograr un estado estable de etiquetado de las celdas de interés (véase la nota en el paso 2.1.3). Aislar los metabolitos siguiendo el protocolo del paso 2.2. Analice las muestras en LC-MS siguiendo el flujo de trabajo descrito en el paso 2.3. Análisis de la actividad de SDH basada en patrones de etiquetadoNOTA: La actividad de oxidación del succinato del complejo SDH puede controlarse evaluando la proporción de 13 C 4-fumarato a 13C4-succinato en el trazado de 13C5-glutamina. La actividad de reducción de fumarato del complejo SDH puede monitorizarse evaluando la proporción de 13 C 3-succinato a 13C3-fumarato en el trazado de 13C5-glutamina.Calcule el porcentaje de etiquetado de 13 C 3-fumarato, 13 C 4-fumarato, 13 C3-succinato y 13 C4-succinato. Por ejemplo, para determinar el porcentaje de 13 C 3-fumarato, sume todas las áreas pico integradas para los isotopólogos de fumarato (fumarato no marcado, 13 C1-fumarato, 13 C2-fumarato, 13 C 3-fumarato y 13 C4-fumarato), y divida el área pico para 13C 3-fumarato por el área total del isotopólogo. Multiplica por 100. Para calcular la oxidación del succinato, divida el porcentaje 13 C 4-fumarato por el porcentaje 13C 4-succinato. Para calcular la reducción de fumarato, divida el porcentaje 13 C 3-succinato por el porcentaje 13C 3-fumarato. 4. Ensayo directo de actividad compleja I NOTA: DCPIP es un aceptor artificial de electrones; Cambia a su forma reducida al aceptar electrones del ubiquinol. En este ensayo, la ubiquinona se reduce a ubiquinol a través de la oxidación compleja mediada por I de NADH a NAD +. Por lo tanto, la medición del recambio de DCPIP oxidado en este ensayo libre de células es un proxy para la actividad del complejo I 7,18. Purificación y cuantificación de las mitocondrias a partir de célulasNOTA: Cualquier protocolo de purificación mitocondrial puede ser utilizado para este ensayo19.Expandir las células hasta obtener 25-100 millones de células. Aspirar el medio de los platos, lavar con 1x PBS, aspirar el PBS y triphilar las células con tripsina al 0,25%. Apagar la tripsina con medio de cultivo y granular las células a 1.000 × g durante 5 min. Lave los gránulos celulares 2 veces en 5 ml de 1x PBS, y repita la centrifugación a 1,000 × g durante 5 minutos para granular las células. Guarde los pellets lavados en un congelador a -20 °C hasta la purificación mitocondrial.NOTA: No congele y descongele los gránulos celulares más de una vez. Prepare el tampón de aislamiento de las mitocondrias (ver Tabla 1).NOTA: Los reactivos que contienen sodio como el NaOH no deben usarse para preparar tampones de aislamiento de mitocondrias, ya que el sodio empaña el potencial de la membrana mitocondrial20 e interrumpe la homeostasis del calcio mitocondrial21. Resuspender los gránulos celulares a 10 millones de células por 1 ml de tampón de aislamiento de mitocondrias. Por ejemplo, resuspender 100 millones de células peletizadas en 10 ml de tampón de aislamiento de mitocondrias.NOTA: Asegúrese de interrumpir los grupos de células sin introducir burbujas en el tampón. Mueva 2 ml de suspensión celular a un homogeneizador de vidrio preenfriado con un volumen de trabajo de 3-8 ml que sea compatible con un mortero de PTFE Potter-Elvehjem. Homogeneizar las células con 10-20 golpes, monitoreando las células bajo un microscopio para confirmar la lisis celular durante todo el proceso de homogeneización. Aumente el número de accidentes cerebrovasculares si es necesario para garantizar una lisis celular eficiente.NOTA: Si la homogeneización de las células con el método anterior no es eficaz para lisar las células, cambie a un método de lisis de jeringa22. Transfiera 2 ml del lisado celular a un tubo de microcentrífuga en hielo y repita los pasos anteriores hasta que toda la suspensión celular esté homogeneizada. Granular los núcleos y los restos celulares a 650 × g durante 10 min en una centrífuga a 4 °C. Mover el sobrenadante a un nuevo tubo de 2,0 ml y repetir la centrifugación anterior a 650 × g durante 10 min a 4 °C. Mover el sobrenadante a un nuevo tubo de 2,0 ml y granular las mitocondrias crudas a 7.000 × g durante 10 minutos en una centrífuga de 4 °C. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 1 ml de tampón de aislamiento de mitocondrias. Mover 50 μL a un nuevo tubo para la cuantificación de proteínas. Repita el paso de centrifugación anterior en las dos alícuotas de la muestra (la muestra de 50 μL y la restante ~950 μL). Deseche el sobrenadante y guarde los gránulos en un congelador a -80 °C hasta que estén listos para usar. Agregue 200 μL de tampón RIPA a los gránulos de la alícuota de 50 μL para extraer la proteína, el vórtice durante 10 minutos y centrifugar a 21,000 × g para aislar la proteína. Cuantificar la cantidad de proteína en la alícuota de 50 μL y utilizar este número para cuantificar la proteína restante en la muestra de 950 μL. Por ejemplo, si la cuantificación de proteínas para la alícuota de 50 μL es de 1 μg/μL, la proteína total en el pellet mitocondrial restante es de 950 μg (1 μg/μL × 950 μL). Realización del ensayo de actividad compleja INOTA: La línea celular de osteosarcoma 143B se utilizó para este ensayo, pero el protocolo se puede adaptar para cualquier célula cultivada.Resuspender las mitocondrias purificadas en el tampón de resuspensión de las mitocondrias (ver Tabla 1) a una concentración final de 5 mg de proteína/ml. Realice cinco ciclos de congelación/descongelación en un congelador de -20 °C para permeabilizar las mitocondrias. Hacer que el ensayo de actividad compleja I tampón (ver Tabla 1). Mezclar 50 ug del stock de mitocondrias de 5 mg/ml con 90 μL de tampón de actividad del complejo I. Preparar cinco réplicas no tratadas y cinco réplicas tratadas con rotenona (5 μM) para controlar la actividad compleja I. Lea la absorbancia de referencia a 600 nm en un lector de placas ajustado a 37 °C. Inicie la reacción agregando NADH a una concentración final de 2 mM, y rastree la absorbancia (600 nm) en el lapso de 1 h, midiendo al menos cada 2 minutos en todo momento. La disminución de la absorbancia es indicativa de una reducción de DCPIP a través de la actividad del complejo I.NOTA: El NADH debe añadirse utilizando una pipeta multicanal para garantizar que todas las muestras se inicien al mismo tiempo. 5. Ensayo basado en LC-MS para medir los niveles de superóxido NOTA: Las propiedades de fluorescencia de MitoSox Red pueden cambiar independientemente de su reacción con el superóxido23. Este ensayo basado en LC-MS mide directamente el producto del superóxido que reacciona con MitoSox Red. El siguiente ensayo está ligeramente modificado de Xiao et al.24. El 2-hidroxi-mitoetidio (2-OH MitoE2+) es el producto de la reacción del superóxido (Figura 5). La línea celular Caki1 se utilizó para este ensayo, pero el protocolo se puede adaptar para cualquier célula cultivada. Tratamiento de células adherentes con MitoSox RedSiembra entre 250.000 y 500.000 células en una placa de 6 pocillos para lograr una confluencia del 75% al día siguiente. Asegúrese de sembrar un conjunto de placas para el ensayo LC-MS y un conjunto duplicado de placas para la normalización del recuento celular. Prepare DMEM completo que contenga 10% de FBS inactivado por calor y 1% de penicilina-estreptomicina en el medio Eagle modificado de Dulbecco. Refresque el medio en todos los pocillos para todas las condiciones con 2 ml de DMEM completo. Asegúrese de agregar cualquier medicamento o tratamiento de interés en este punto. Incubar las células en una incubadora de cultivo de tejidos durante 1 h. Preparar controles positivos y negativos. Preparar una reserva de 50 mM de hidroperóxido de terc-butilo diluido en PBS y una reserva de 250 mM de N-acetilcisteína (NAC) diluida en DMSO (ver Tabla 1).NOTA: El hidroperóxido de terbutilo (tBuOOH) es una potente especie reactiva de oxígeno que actuará como un control positivo y aumentará la cantidad de 2-OH MitoE2+. NAC es un potente antioxidante que actuará como un control negativo y neutralizará la producción de superóxido causada por tBuOOH. Añadir 1 μL de tBuOOH a los pocillos de control positivo y 1 μL de tBuOOH + 100 μL de NAC a los pocillos de control negativo.NOTA: El uso de una pipeta P2 (rango de 0,1-2 μL) es la forma óptima de transferir 1 μL. Incubar durante 1 h en una incubadora de cultivo de tejidos. Preparar 1 mM de caldo de MitoSox Red (ver Tabla 1) y añadir 2 μL de 1 mM de MitoSox Red a cada pocillo para lograr una concentración final de 1 μM. Incubar durante 30 min en una incubadora de cultivo de tejidos. Durante esta incubación final, cuente una de las placas duplicadas para adquirir los recuentos de células para normalizar los datos finales de LC-MS. Aislamiento del producto Mitosox Red oxidado de las células adherentesObtenga un cubo de hielo seco y coloque isopropanol frío de grado HPLC en el hielo seco antes de comenzar el aislamiento. Sacando un plato a la vez, aspire el medio de los pocillos y lave 2x con 1 ml de 1x PBS. Aspire todo el PBS residual de los pocillos antes de pasar al siguiente paso.NOTA: Asegúrese de inclinar el plato durante la aspiración y pipetear contra la pared del plato para evitar la interrupción de las células adherentes. Coloque la placa sobre hielo seco y agregue 800 μL de isopropanol de grado HPLC a cada pocillo. Incubar la placa durante al menos 15 minutos en un congelador de -80 °C para facilitar la lisis celular.NOTA: En este punto, se puede sacar la siguiente placa de la incubadora y repetir los pasos 5.2.1-5.2.4. Continúe hasta que todas las placas se incuben en el congelador de −80 °C. Sacando un plato a la vez del congelador, raspe cada pocillo en hielo seco con un elevador de células y transfiera el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mantenga el tubo en hielo seco hasta el siguiente paso. Vortex todos los tubos durante 10 min a 4 °C, y luego centrifugar a 4 °C durante 10 min a velocidad máxima (al menos 17.000 × g). Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y séquelo en un concentrador de vacío. Una vez que el lisado se haya secado, almacenar los gránulos de metabolitos a -80 °C hasta que estén listos para la LC-MS. Medición LC-MS de MitoSox Red y 2-hidroxi-mitoetidio (2-OH MitoE2+)Prepare las muestras para LCMS en hielo agregando 100 μL de una mezcla 3:3:1 de MeOH:cloroformo:agua de grado HPLC. Vórtice durante 10 min a 4 °C. Mover 25 μL en cada vial de LC-MS. Conservar la muestra restante en el congelador a -80 °C. Prepare los siguientes tampones de cromatografía líquida: i) tampón A: agua de grado HPLC con 0,1% de ácido fórmico; ii) tampón B: acetonitrilo de grado HPLC con 0,1% de ácido fórmico. Abra la aplicación Thermo XCalibur Instrument Setup para empezar a desarrollar el método. Busque dos cuadros en la barra lateral izquierda de esta ventana: el primer cuadro permite el desarrollo del método de cromatografía y el segundo cuadro permite el desarrollo del método de espectrometría de masas. Desarrollo del método de cromatografía líquida:Establezca un caudal de 0,25 ml / min e inicie el método al 20% B, aumentando al 95% B en el lapso de 12 min. Durante el siguiente minuto, reduzca el búfer B al 20% B y mantenga ese nivel durante los próximos 2 minutos.NOTA: Los últimos 2 minutos de flujo al 20% B son críticos para que la presión de la columna vuelva a caer a la presión inicial y equilibre la columna con las relaciones de amortiguación apropiadas. Si no se incluye este paso de equilibrio, los tiempos de retención cambiarán para todas las muestras ejecutadas posteriormente. Cree un archivo de ajuste con los siguientes parámetros:Abra la aplicación Tune y cree un nuevo archivo de melodía. Aplique también cualquier configuración superpuesta del módulo Configuración del método (consulte el paso 5.3.9.3) a este archivo de ajuste, incluido el rango de escaneo, la resolución, la polaridad, el destino AGC y la TI máxima. Ajuste el gas Sheath a 30, el gas Aux a 3 y el gas Sweep a 3 también. Ajuste el voltaje de pulverización a 3 kV, la temperatura capilar a 300 y el nivel de RF de lente S a 60. Desarrollo del método de espectrometría de masas:En la lista inferior izquierda de posibles análisis, arrastre y suelte Full MS en el centro de la ventana. Asegúrese de hacer clic en el cuadrado Full MS después de la caída para ajustar la configuración. La duración total del método MS es de 13 min.NOTA: El método LC es más largo que el método MS porque los últimos 2 min son para reacondicionamiento de columna y no para cuantificación de metabolitos. En el lado derecho del módulo, en Propiedades del método, asegúrese de que la duración del método y el tiempo de ejecución estén establecidos en 13,00 min. Ejecute este análisis completo en modo positivo con una resolución de 70.000 y un objetivo de AGC de 1 × 106. Establezca el Máximo de TI en 100 ms y el rango de escaneo de 300 m/z a 700 m/z. En Archivos de sintonía hacia la parte superior del módulo, observe que el archivo de sintonía que se acaba de crear está vinculado a este método. Ejecute el método para la detección de MitoSox Red con inyecciones de muestra de 2 μL.

Representative Results

Las actividades de DHODH, complejo I y complejo V pueden evaluarse mediante ensayos de proliferación. Tras la privación de uridina del medio de cultivo, las células se vuelven más dependientes de la vía de novo para la biosíntesis de pirimidina. Por lo tanto, cuando las células fueron desafiadas a proliferar en un medio libre de uridina, fueron más sensibles a la inhibición de la actividad de DHODH por brequinar que las células cultivadas en un medio que contiene uridina (Figura 6A). Del mismo modo, la privación de piruvato del medio de cultivo hace que las células sean más dependientes de la actividad del complejo I para la proliferación. Por lo tanto, cuando las células fueron desafiadas a proliferar en un medio libre de piruvato, fueron más sensibles a la inhibición de la actividad del complejo I por rotenona que las células cultivadas en un medio que contiene piruvato (Figura 6B). La actividad del complejo V se puede evaluar desafiando a las células a proliferar en un medio que contenga galactosa en lugar de glucosa. Como la galactosa produce cero ATP neto en la glucólisis, las células que crecen en este combustible dependen más de la síntesis de ATP mitocondrial a través de la actividad del complejo V. Por lo tanto, las células que proliferan en un medio que contiene galactosa fueron más sensibles a la inhibición del complejo V por oligomicina que las células que proliferan en un medio que contiene glucosa (Figura 6C). La actividad de SDH puede medirse utilizando el rastreo de13 C 5-glutamina y monitorizando su incorporación en isótopologos defumarato y succinato. En condiciones tratadas con vehículo, el complejo SDH favoreció la actividad hacia adelante, y la incorporación de 13 C 4-succinato en 13 C4-fumarato fue mayor que la incorporación de 13 C 3-fumarato en 13C 3-succinato (Figura 7). En condiciones tratadas con antimicina, el complejo SDH favoreció la actividad inversa, y la incorporación de 13 C 3-fumarato en 13 C3-succinato fue mayor que la incorporación de 13 C 4-succinato en 13C 4-fumarato (Figura 7). La producción de superóxido dentro de las mitocondrias se puede medir utilizando el reportero fluorescente MitoSox, que genera 2-hidroxi-mitoetidio al reaccionar con el superóxido. En este estudio, las células tratadas con MitoSox en presencia de peróxido de hidrógeno de terbutilo tenían niveles más altos de 2-hidroxi-mitoetidio de una manera que fue suprimida por la adición de NAC, un antioxidante que apaga las ROS celulares (Figura 8). Figura 1: Base mecanicista para el ensayo de proliferación compleja V. Oxidación de glucosa y galactosa vía glucólisis. La glucosa produce dos ATP netos de la glucólisis, mientras que la galactosa produce ATP neto cero porque se requiere la síntesis de UTP para la UDP-galactosa. Por lo tanto, las células cultivadas en galactosa son más dependientes de la síntesis de ATP mitocondrial debido a la falta de ATP producido por la glucólisis. Abreviaturas: GALK = galactokinase; GALT = galactosa-1-fosfato uridiltransferasa; PGM1 = fosfoglucomutasa 1; GPI = glucosa-6-fosfato isomerasa, UGP = UDP-glucosa pirofosforilasa; GALE = UDP-galactosa-4-epimerasa; NDK = nucleótido difosfato quinasa; UMPK = uridina monofosfato quinasa; HK = hexoquinasa; PFK = fosfofructoquinasa; ALDO = aldolasa; ITP = triosafosfato isomerasa; GAPDH = gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; PGK = fosfoglicerato quinasa; PGM = fosfoglucomutasa; ENO = enolasa; PK = piruvato quinasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Base mecanicista para el ensayo complejo de proliferación I. Esquema de las vías metabólicas que se alteran tras la inhibición de la actividad del complejo I. En medios con alto contenido de piruvato, la inhibición del complejo I se deriva a través de la oxidación de NADH mediada por LDH. En medios de bajo piruvato, esta adaptación es menos factible, lo que hace que las células dependan más de la actividad del complejo I para reoxidar NADH. Abreviaturas: LDH = lactato deshidrogenasa; Ciclo de TCA = ciclo de ácido tricarboxílico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Esquema de la reacción de DHODH tras el trazado de 13Cde 4-aspartato. Brequinar inhibe la oxidación del dihidroorotato a orotado, evitando así la síntesis posterior de UMP. 13El4-aspartato C se incorpora a 13C3-UMP a través de la actividad DHODH. Abreviaturas: OMM = membrana mitocondrial externa; IMM = membrana mitocondrial interna; DHODH = dihidroorotato deshidrogenasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Medición de la actividad directa e inversa del complejo II a través del trazado de5-glutamina 13C. Para medir la actividad directa del complejo II (izquierda), se monitoriza la incorporación de 13 C 5-glutamina en 13 C 4-succinato y 13C 4-fumarato. Para medir la actividad inversa del complejo II (derecha), se monitoriza la incorporación de 13 C 5-glutamina en 13 C 3-succinato y 13C 3-fumarato. Abreviaturas: SDH = succinato deshidrogenasa; CytC = citocromo C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Reacción de MitoSox Red con superóxido. La reacción de MitoSox con superóxidos mitocondriales para formar 2-OH-MitoE2+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Ensayos basados en la proliferación para medir la función mitocondrial (A) Proliferación de células de osteosarcoma 143B tratadas con brequinar 5 uM, un inhibidor de DHODH, en medio con uridina de ±100 ug/mL. Los datos son medias ± SEM; N = 3 por condición. (B) Proliferación de células de osteosarcoma 143B tratadas con rotenona 2 uM, un inhibidor del complejo I, en medio con piruvato de ±5 mM. Los datos son medias ± SEM; N = 3 por condición. (C) Proliferación de células de osteosarcoma 143B tratadas con oligomicina 5 uM, un inhibidor del complejo V, en medio con 10 mM de glucosa o 10 mM de galactosa como única fuente central de carbono. Los datos son medias ± SEM; N = 3 por condición. * indica p < 0.05 usando una prueba ANOVA unidireccional en Graphpad Prism. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Rastreo de 13C5-glutamina para medir la actividad del complejo II. Oxidación de succinato y reducción de fumarato (SDH inversa) en células Caki1 y DLD1 tratadas con DMSO y 500 nM antimicina A. Los datos representan la media ± SEM; N = 3 por condición. indica p < 0,05 utilizando una prueba t no pareada en GraphPad Prism. Abreviaturas: SDH = oxidación de succinato; SDH inversa = reducción del fumarato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8: Ensayo MitoSox basado en LCMS para detectar superóxido. Cromatograma iónico extraído de 2-OH-Mito E2+ aislado de células Caki1 tratadas con MitoSox durante 30 min en presencia de tBuOOH ± NAC. Abreviaturas: LCMS = cromatografía líquida-espectrometría de masas; NAC = N-acetilcisteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Tabla 1: Composición de reactivos, tampones y medios utilizados en este protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discussion

Como la investigación emergente demuestra que las mitocondrias de los mamíferos pueden funcionar sin consumir oxígeno molecular, es de suma importancia para los investigadores emplear ensayos ortogonales, más allá de las mediciones de OCR, para cuantificar con precisión la función mitocondrial. Aquí, compilamos una serie de ensayos que se pueden usar para evaluar directamente las actividades del complejo I, complejo II, complejo V y DHODH midiendo el equilibrio mitocondrial NAD + / NADH, la utilización de aceptores de electrones terminales adaptativos, la producción de ATP, biosíntesis de pirimidina de novo y ROS derivadas de mitocondrias. En particular, estos ensayos miden más directamente la función mitocondrial que las mediciones de OCR. Además, estos ensayos proporcionan a los investigadores formas manejables de cuantificar la función mitocondrial durante la hipoxia, para la cual las mediciones de OCR son en gran medida irrelevantes debido a que el fumarato se utiliza como el aceptor terminal de electrones preferido. Finalmente, los métodos basados en la proliferación descritos aquí son más rentables que los experimentos clásicos de respirometría , proporcionando así una forma ampliamente accesible de estudiar la función mitocondrial en sistemas de mamíferos.

Existen consideraciones clave al utilizar estos ensayos para medir la función mitocondrial en células cultivadas. En cuanto a los ensayos de proliferación, es importante ajustar el número de células sembradas para la tasa de duplicación de cada línea celular. Las células deben sembrarse al menos al 10% de confluencia y con suficiente espacio para permitir tres o cuatro duplicaciones para que se puedan cuantificar las diferencias en la proliferación. Otra consideración para cada ensayo es la concentración de las moléculas pequeñas utilizadas como controles para las actividades de cada complejo ETC. Como diferentes líneas celulares pueden exhibir diferentes sensibilidades a estos inhibidores, es fundamental probar la dosis de estas pequeñas moléculas para identificar la concentración óptima.

Una limitación universal de los ensayos que estudian la función mitocondrial in vitro, incluidas las mediciones de OCR y todos los ensayos descritos aquí, es la composición metabólica del medio de cultivo. El medio de cultivo celular estándar tiende a sesgar los sistemas en niveles superficialmente altos de función mitocondrial. Por ejemplo, los niveles suprafisiológicos de glutamina aumentan su anaplerosis del ciclo25 de TCA, que alimenta la síntesis de NADH mitocondrial y, en consecuencia, aumenta la fosforilación oxidativa. Del mismo modo, la presión parcial de oxígeno oscila entre 3 mmHg y 100 mmHg (aproximadamente 0,1% -13%O2) en tejidos de mamíferos, pero es atmosférica (140 mmHg, aproximadamente 21%) in vitro26,27. Este exceso deO2 maximiza la capacidad respiratoria mitocondrial y la producción de superóxido28. Recientemente, se han hecho esfuerzos para diseñar medios de cultivo para que sean más fisiológicos29,30. En particular, el cultivo de células en medios similares al plasma humano disminuye la respiración mitocondrial en algunas líneas celulares cancerosas30, las ROS mitocondriales en las células T 31 y las adaptaciones mitocondriales a la terapéutica del cáncer32. Por lo tanto, es fundamental tener en cuenta la composición de los medios de cultivo que se utilizan y comprender cómo pueden afectar la función mitocondrial.

Otra limitación importante y universal en la interpretación de la función mitocondrial es el potencial de diferencias en el número de mitocondrias. Por lo tanto, es fundamental medir el contenido mitocondrial a través de la cuantificación del ADNmt33, la medición de la masa mitocondrial con colorantes insensibles al potencial de membrana34 o la transferencia occidental de marcadores mitocondriales. Este es un control crítico para que una disminución en el número de mitocondrias no se confunda con una disminución en la función mitocondrial.

También existen limitaciones específicas y solución de problemas que se aplican a los ensayos descritos aquí. En primer lugar, dado que las células diferenciadas no proliferan, los ensayos basados en la proliferación no serán útiles para evaluar la función mitocondrial en este contexto. Una limitación clave del protocolo de rastreo de 13C 4-aspartato para medir la actividad de DHODH es que la absorción de aspartato en las células puede ser extremadamente ineficiente35. Para superar esta limitación potencial, los investigadores pueden sobreexpresar el transportador de aspartato, SLC1A3, para facilitar la captación de 13C 4-aspartato35.

Una limitación del protocolo que utiliza el rastreo de5-glutamina 13C para medir la actividad de SDH es que este ensayo requiere que las células utilicen la vía de carboxilación reductiva para enriquecer los isotopólogos M + 3 con el fin de medir la actividad inversa. Algunas líneas celulares son incapaces de reducir el flujo de carboxilación debido a la baja expresión de citrato liasa de ATP36, la estabilización insuficiente de HIF37 o una relación α-KG:citrato demasiado baja38. Para superar esta limitación, se podría utilizar elrastreo de13 C 4-aspartato para medir las actividades de avance e inversión de los DSS7. En este ensayo, la actividad directa SDH se puede medir por la relación de fumarato M+2:succinato M+2 y la reacción inversa por succinato M+4:fumarato M+4. En particular, este rastreo elude la mayoría de las enzimas en la vía reductiva de carboxilación.

Una limitación del ensayo de actividad compleja I utilizando la reducción DCPIP como lectura es que las mitocondrias no están estructuralmente intactas. El proceso de congelación-descongelación de las mitocondrias para permitir su absorción de NADH para el ensayo ciertamente puede empañar la integridad estructural de la membrana mitocondrial39. Este ensayo debe realizarse en paralelo con ensayos como el ensayo de proliferación del complejo I para garantizar que los cambios en la actividad del complejo I observados también sean ciertos con las células intactas.

En estudios futuros, algunas de estas técnicas pueden adaptarse para medir las funciones mitocondriales in vivo utilizando organismos modelo como ratones y Caenorhabditis elegans. Los métodos actuales utilizados para medir la función mitocondrial in vivo se centran en el OCR a nivel orgánico, específicamente la tasa de intercambio respiratorio cuando se utilizan modelos de ratón. Una limitación clara de este método es que el oxígeno cumple muchas funciones bioquímicas y de señalización más allá de su papel como aceptor terminal de electrones ubicuo en el CTE mitocondrial. Por ejemplo, el oxígeno es “consumido” por la actividad catalítica de las enzimas de la familia de la dioxigenasa. Aunque estas enzimas contribuyen a la tasa de consumo de oxígeno celular, no participan, regulan ni reflejan la función mitocondrial. Los experimentos clásicos de respirometría in vitro típicamente controlan el “OCR no mitocondrial”, mientras que los experimentos de relación de intercambio respiratorio (RER) del organismo no pueden controlar esto, lo que limita la interpretación del RER como una métrica para la función mitocondrial in vivo. Sin embargo, es factible adaptar los protocolos para medir la actividad de DHODH a través del trazado de 13 C 4-aspartato, la actividad del complejo II a través del rastreo de 5-glutamina 13 C, la actividad del complejo I en mitocondrias purificadas de tejidos y ROS mitocondriales utilizando compuestos amigables con LC-MS como MitoB para medir la función mitocondrial in vivo . Estos ensayos directos para interrogar las funciones mitocondriales, en combinación con los experimentos clásicos de respirometría, proporcionan a los investigadores una evaluación más completa y precisa de la función mitocondrial en células y tejidos de mamíferos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Las figuras producidas en este manuscrito fueron creadas con BioRender.com. Agradecemos a Amy Walker por proporcionar comentarios sobre este artículo. J.B.S. fue apoyado por la Fundación Worcester para la Beca de Investigación Biomédica.

Materials

 1.5 mL tube Cell Treat 667443
2.0 mL tube Cell Treat 229446
6-well plate Cell Treat 229106
12-well plate Cell Treat 229112
13C4-aspartate Sigma-Aldrich 604852
13C5-Glutamine Cambridge Isotope Laboratories 285978-14-5
15 mL centrifuge tube Cell Treat 667411
50 mL centrifuge tube Cell Treat 667421
150 mm tissue culture dish Cell Treat 229651
1x Phosphate-buffered saline Gibco 10010049
2,6-dichlorophenolindophenol Honeywell 33125
Ammonium Carbonate Sigma-Aldrich 37999
Antimycin Sigma-Aldrich A8674
Ascentis Express C18 Sigma-Aldrich 53825-U
Bottle top filter 500 mL, 0.22 µm, PES 9 9 mm membrane diameter Cell Treat 229717
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3294
Brequinar Sigma-Aldrich SML0113
Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade Cell Treat 229305
CentriVap -105 Cold Trap Labconco 7385020
Complete Protease Inhibitor Tablets Sigma-Aldrich  4693116001
Coulter Counter Cups Fisher Scientific 07-000-694
Decylubiquinone Sigma-Aldrich D7911
DMSO Invitrogen D12345
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11995-065
EDTA Sigma-Aldrich E6758
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Eppendorf Centrifuge 5425R Eppendorf 2231000908
Eppendorf Centrifuge 5910 Ri Eppendorf 5943000343
Galactose Sigma-Aldrich G5388
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glucose-free DMEM Gibco 11966025
Glutamine-free DMEM Thermo Fisher 11960044
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135
Hepes Sigma-Aldrich H3375
HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide Thermo Scientific 460801000
HPLC-grade Acetonitrile Sigma-Aldrich 900667
HPLC-grade Chloroform Sigma-Aldrich 366927
HPLC-grade formic acid Thermo Scientific 28905
HPLC-grade Isopropanol Sigma-Aldrich 563935
HPLC-grade MeOH Sigma-Aldrich 900688
HPLC-grade Water Sigma-Aldrich 270733
Human Osteosarcome Cell Line 143B ATCC CRL-8303
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331-500ML
Isotone buffer Beckman Coulter 8546719
K2HPO4 Sigma-Aldrich P2222
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
MitoSox Red Invitrogen M36008
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351-5MG
Pencillin Streptomycin Gibco 15140-122
Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21 Kimble 885502-0021
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Pyruvate-free DMEM media Gibco 11965175
Q Exactive Plus Mass Spectrometer Thermo Scientific 726030
ReCO2ver Incubator Baker
Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator Labconco 7310020
RIPA Buffer Millipore Sigma 20188
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2.1 mm analytical column Sigma-Aldrich 1.50460.0001
SeQuant ZIC-pHILIC guard kit Millipore Sigma 1.50438.0001
Sodium Hydroxide, Pellets Millipore Sigma 567530-250GM
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SW, TRACEFINDER 5.1 SP3 Thermo Scientific OPTON-31001
Tert-butyl hydroperoxide solution Sigma-Aldrich 458139
Tris Sigma-Aldrich 93352
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25-200-114
Uridine Sigma-Aldrich U3003
VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC Thermo Scientific VF-S01-A-02
Z2 Coulter Particle count and size analyzer Beckman Coulter BZ10131270
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16080 (2016).
  3. Chandel, N. S., et al. Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: A mechanism of O2 sensing. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25130-25138 (2000).
  4. Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, C. I., Stoppani, A. O. M. Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome C reductase from beef-heart mitochondria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 180 (2), 248-257 (1977).
  5. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
  6. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
  7. Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
  8. Kumar, R., et al. A redox cycle with complex II prioritizes sulfide quinone oxidoreductase-dependent H(2)S oxidation. Journal of Biological Chemistry. 298 (1), 101435 (2022).
  9. Warburg, O., Geissler, A. W., Lorenz, S. On growth of cancer cells in media in which glucose is replaced by galactose. Hoppe-Seyler’s Zeitschrift für Physiologische Chemie. 348 (12), 1686-1687 (1967).
  10. Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicological Sciences. 97 (2), 539-547 (2007).
  11. Attardi, G., King, M. P. Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  12. Bodnar, A. G., Cooper, M., Leonard, J. V., Schapira, A. H. Respiratory-deficient human fibroblasts exhibiting defective mitochondrial DNA replication. Biochemical Journal. 305, 817-822 (1995).
  13. Gregoire, M., Morais, R., Quilliam, M. A., Gravel, D. On auxotrophy for pyrimidines of respiration-deficient chick embryo cells. European Journal of Biochemistry. 142 (1), 49-55 (1984).
  14. Mackay, G. M., Zheng, L., vanden Broek, N. J., Gottlieb, E. Analysis of cell metabolism using LC-MS and isotope tracers. Methods in Enzymology. 561, 171-196 (2015).
  15. Heinrich, P., et al. Correcting for natural isotope abundance and tracer impurity in MS-, MS/MS- and high-resolution-multiple-tracer-data from stable isotope labeling experiments with IsoCorrectoR. Scientific Reports. 8 (1), 17910 (2018).
  16. Lee, P., Chandel, N. S., Simon, M. C. Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (5), 268-283 (2020).
  17. Bisbach, C. M., et al. Succinate can shuttle reducing power from the hypoxic retina to the O(2)-rich pigment epithelium. Cell Reports. 31 (2), 107606 (2020).
  18. Angebault, C., et al. Idebenone increases mitochondrial complex I activity in fibroblasts from LHON patients while producing contradictory effects on respiration. BMC Research Notes. 4, 557 (2011).
  19. Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).
  20. Iwai, T., et al. Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts. Cardiovascular Research. 55 (1), 141-149 (2002).
  21. Murphy, E., Eisner, D. A. Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in health and disease. Circulation Research. 104 (3), 292-303 (2009).
  22. Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. Journal of Visualized Experiments. (97), e52076 (2015).
  23. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
  24. Xiao, Y., Meierhofer, D. Are hydroethidine-based probes reliable for reactive oxygen species detection. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (4), 359-367 (2019).
  25. DeBerardinis, R. J., et al. Beyond aerobic glycolysis: Transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19345-19350 (2007).
  26. Keeley, T. P., Mann, G. E. Defining physiological normoxia for improved translation of cell physiology to animal models and humans. Physiological Reviews. 99 (1), 161-234 (2019).
  27. Ast, T., Mootha, V. K. Oxygen and mammalian cell culture: Are we repeating the experiment of Dr. Ox. Nature Metabolism. 1 (9), 858-860 (2019).
  28. Gu, C., Jun, J. C. Does hypoxia decrease the metabolic rate. Frontiers in Endocrinology. 9, 668 (2018).
  29. Voorde, J., et al. Improving the metabolic fidelity of cancer models with a physiological cell culture medium. Scientific Advances. 5 (1), 7314 (2019).
  30. Cantor, J. R., et al. Physiologic medium rewires cellular metabolism and reveals uric acid as an endogenous inhibitor of UMP synthase. Cell. 169 (2), 258-272 (2017).
  31. MacPherson, S., et al. Clinically relevant T cell expansion media activate distinct metabolic programs uncoupled from cellular function. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 24, 380-393 (2022).
  32. Torres-Quesada, O., Doerrier, C., Strich, S., Gnaiger, E., Stefan, E. Physiological cell culture media tune mitochondrial bioenergetics and drug sensitivity in cancer cell models. Cancers. 14 (16), 3917 (2022).
  33. Chan, S. W., Chen, J. Z. Measuring mtDNA damage using a supercoiling-sensitive qPCR approach. Methods in Molecular Biology. 554, 183-197 (2009).
  34. Doherty, E., Perl, A. Measurement of mitochondrial mass by flow cytometry during oxidative stress. Reactive Oxygen Species. 4 (10), 275-283 (2017).
  35. Birsoy, K., et al. An essential role of the mitochondrial electron transport chain in cell proliferation is to enable aspartate synthesis. Cell. 162 (3), 540-551 (2015).
  36. Beigneux, A. P., et al. ATP-citrate lyase deficiency in the mouse. Journal of Biological Chemistry. 279 (10), 9557-9564 (2004).
  37. Gameiro, P. A., et al. In vivo HIF-mediated reductive carboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cells to glutamine deprivation. Cell Metabolism. 17 (3), 372-385 (2013).
  38. Fendt, S. M., et al. Reductive glutamine metabolism is a function of the alpha-ketoglutarate to citrate ratio in cells. Nature Communications. 4, 2236 (2013).
  39. Lee, C. P. Biochemical studies of isolated mitochondria from normal and diseased tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1271 (1), 21-28 (1995).

Tags

Mitochondrial FunctionOxygen-independent AssaysHypoxiaMetabolite AnalysisFumarateElectron Transport ChainATP ProductionPyrimidine BiosynthesisNADH OxidationSuperoxide ProductionRespirometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tseyang, T., Valeros, J., Vo, P., Spinelli, J. B. Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals. J. Vis. Exp. (195), e65184, doi:10.3791/65184 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image