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生物化学

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

Published: May 19, 2023
doi:
10.3791/65184
, , ,
1Program in Molecular Medicine,University of Massachusetts Chan Medical School, 2Cancer Center,University of Massachusetts Chan Medical School

Summary

Aqui, apresentamos uma compilação de ensaios para medir diretamente a função mitocondrial em células de mamíferos, independentemente de sua capacidade de consumir oxigênio molecular.

Abstract

O fluxo de elétrons na cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) suporta funções biossintéticas, bioenergéticas e de sinalização multifacetadas em células de mamíferos. Como o oxigênio (O 2) é o mais onipresente aceitador de elétrons terminais para a ETC de mamíferos, a taxa de consumo de O2 é frequentemente usada como proxy da função mitocondrial. No entanto, pesquisas emergentes demonstram que esse parâmetro nem sempre é indicativo da função mitocondrial, já que o fumarato pode ser empregado como um aceitador alternativo de elétrons para sustentar funções mitocondriais na hipóxia. Este artigo compila uma série de protocolos que permitem aos pesquisadores medir a função mitocondrial independentemente da taxa de consumo de O2. Estes ensaios são particularmente úteis quando se estuda a função mitocondrial em ambientes hipóxicos. Especificamente, descrevemos métodos para medir a produção de ATP mitocondrial, biossíntese de pirimidina de novo, oxidação de NADH pelo complexo I e produção de superóxido. Em combinação com experimentos clássicos de respirometria, esses ensaios ortogonais e econômicos fornecerão aos pesquisadores uma avaliação mais abrangente da função mitocondrial em seu sistema de interesse.

Introduction

A função mitocondrial é uma métrica crítica da saúde celular, pois sustenta funções-chave biossintéticas, bioenergéticas e de sinalização em células de mamíferos1. A grande maioria das funções mitocondriais requer fluxo de elétrons através da cadeia de transporte de elétrons (ETC), e interrupções no fluxo de elétrons na ETC causam doença mitocondrial grave2. O ETC é composto por uma série de reações de redução e oxidação (redox) que estão embutidas na membrana mitocondrial interna, e essas reações de transferência de elétrons liberam energia livre que pode ser aproveitada para apoiar a síntese de ATP, processos fisiológicos como a termogênese, vias biossintéticas como a biossíntese de pirimidina de novo e o equilíbrio do status redox de cofatores como NADH. Os complexos I e III da ETC produzem espécies reativas de oxigênio (ROS)3,4,5, que, por sua vez, regulam vias chave de sinalização, como HIF, PI3K, NRF2, NFκB e MAPK 6. Consequentemente, métricas de fluxo de elétrons no ETC são classicamente usadas como um proxy para a função mitocondrial em células de mamíferos.

Experimentos de respirometria são frequentemente empregados para medir a função mitocondrial em células de mamíferos. Uma vez que O2 é o mais onipresente aceitador de elétrons terminais para a ETC de mamíferos, sua redução é usada como um proxy para a função mitocondrial. No entanto, evidências emergentes demonstram que mitocôndrias de mamíferos podem empregar fumarato como um aceitador de elétrons para sustentar funções mitocondriais que dependem da ETC, incluindo a biossíntese de pirimidina de novo 7, a oxidação de NADH7 e a desintoxicação do sulfeto de hidrogênio 8. Assim, em determinados contextos, especialmente em ambientes hipóxicos, as medidas da taxa de consumo de O2 (OCR) não fornecem uma indicação precisa ou precisa da função mitocondrial.

Aqui, descrevemos uma série de ensaios que podem ser empregados para medir a função mitocondrial independentemente do OCR. Nós fornecemos ensaios para medir diretamente a oxidação de NADH mediada pelo complexo I, a biossíntese de pirimidina de novo mediada por diidrororotato desidrogenase, a síntese de ATP dependente do complexo V complexo, a direcionalidade líquida do complexo succinato desidrogenase (SDH) e as ERO derivadas da mitocôndria. Estes ensaios devem ser realizados em células de mamíferos cultivadas, embora muitos possam ser adaptados para estudar as funções mitocondriais in vivo. Notavelmente, os ensaios descritos neste protocolo são medidas mais diretas das funções mitocondriais do que o OCR. Além disso, permitem medir a função mitocondrial na hipóxia, contexto em que o OCR não é uma medida indicativa. Em conjunto, esses ensaios, em combinação com experimentos clássicos de respirometria, fornecerão aos pesquisadores uma avaliação mais abrangente da função mitocondrial em células de mamíferos.

Protocol

1. Ensaios de proliferação para medir a atividade do complexo I, diidroorotato desidrogenase (DHODH) e atividades do complexo V Células semeadoras para ensaios de proliferaçãoNOTA: Este protocolo utiliza a linhagem celular de osteossarcoma humano 143B adquirida comercialmente da ATCC. Essa linhagem celular foi utilizada de acordo com as diretrizes do protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Biossegurança (CIB).Remova as placas da incubadora de cultura de tecidos. Aspirar o meio das placas e lavar com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover qualquer meio que sobrar. Aspirar o PBS e cobrir a placa com 0,05%-0,25% de tripsina para levantar as células do fundo da placa. Aguarde 3-5 min para que a tripsina libere as células da placa e, em seguida, extinguir a tripsina com 10 mL do meio de crescimento desejado contendo 10% de soro fetal bovino (SFB). Coletar as células em um tubo cônico e centrifugar a 1.000 × g por 5 min para peletizar as células. Aspirar o meio do tubo sem perturbar o pellet. Ressuspenda o pellet com meio completo. Conte as células e quantifique o volume necessário para semear entre 10.000 e 25.000 células em uma placa de 6 poços.NOTA: Cada linha celular precisará ser otimizada para o número de células a serem semeadas. A confluência ideal alcançada é de ~10% no início do experimento e ~80% no final do experimento. Pipetar as células em uma placa de 6 poços e adicionar 2 mL de meio completo aos poços. Deixe descansar por 24 h antes de mudar para as condições do meio experimental.NOTA: Semeando pelo menos três repetições por condição e poços suficientes para testar a condição de controle não tratada, a condição de controle tratada com inibidor, a condição experimental não tratada e a condição experimental tratada com inibidor. Mudança de meio para avaliar a atividade do complexo V por proliferaçãoNOTA: Células que proliferam em meio com galactose são dependentes da atividade do complexo V para síntese deATP9,10. Ao contrário da glicose, que produz dois ATP líquidos da glicólise, a galactose não produz nenhum, forçando as células a serem dependentes do complexo V para a síntese de ATP (Figura 1). O inibidor do complexo V oligomicina é usado como controle.Produzir meio contendo glicose a 10 mM (ver Tabela 1). Fazer meio contendo galactose a 10 mM (ver Tabela 1). Mude o meio em cada poço para DMEM contendo glicose ou DMEM contendo galactose. Adicionar 5 μM de oligomicina (o inibidor do complexo V) aos poços relevantes e o mesmo volume de DMSO aos poços não tratados. O estoque de oligomicina é de 10 mM ressuspenso em DMSO. Coloque a placa de volta na incubadora de cultura de tecidos por 2 dias. Mudança de meio para avaliar a atividade do complexo I por proliferaçãoNOTA: As células que proliferam em meio isento de piruvato são mais dependentes da atividade do complexo I11,12. Sem piruvato, as células cultivadas necessitam do complexo I para facilitar a maior parte da reoxidação do NADH de volta ao NAD+ (Figura 2). O inibidor do complexo I rotenona é usado como controle.Fazer meio DMEM livre de piruvato suplementado com 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina. Fazer uma solução de piruvato 1 M (ver quadro 1). Troque o meio em cada poço para meio sem piruvato ou meio contendo piruvato. Adicionar 2 μM de rotenona (inibidor do complexo I) aos poços tratados e o mesmo volume de DMSO aos poços não tratados. O estoque de rotenona é de 25 mM ressuspendido em DMSO. Coloque a placa de volta na incubadora de cultura de tecidos por 2 dias. Alteração do meio para avaliar a atividade de DHODH por proliferaçãoNOTA: As células que proliferam em um meio livre de uridina requerem atividade da diidrorotato desidrogenase (DHODH)11,12,13. Na ausência de uridina exógena, as células cultivadas sintetizam pirimidinas através da via de novo. O inibidor de DHODH brequinar é usado como controle.Fazer DMEM livre de uridina suplementado com 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina. Fazer uma solução-mãe de uridina a 10 mg/ml e, em seguida, preparar um meio de uridina de 100 μg/ml (ver Tabela 1). Troque o meio em cada poço para meio livre de uridina ou meio contendo uridina. Adicionar 5 μM de brequinar (o inibidor de DHODH) aos poços tratados e o mesmo volume de DMSO aos poços não tratados. O estoque brequinar é de 10 mM ressuspendido em DMSO. Coloque a placa de volta na incubadora de cultura de tecidos por 2 dias. Contagem das células para ensaios de proliferaçãoPara todos os experimentos, reabastecer o meio a cada 2 dias. Se o meio ficar de cor amarela, aumente a frequência das mudanças do meio. Permita que as células se proliferem por até 7 dias e interrompa o experimento se algum dos poços começar a parecer supercrescido. Os poços são considerados cobertos quando a confluência excede 80%. Aspirar o meio, lavar com 1x PBS e cobrir o fundo do poço com tripsina a 0,25% (500 μL para uma placa de 6 poços). Aguarde 5 min até que as células tenham retirado o prato. Verifique isso ao microscópio. Temperar a tripsina com 1 mL de DMEM completo contendo FBS a 10%. Pipetar para cima e para baixo para quebrar os aglomerados celulares. Prepare os copos de balcão Coulter enchendo cada um com 10 mL de tampão isótônico (um copo por poço). Conte as células em um contador de células e registre os dados. Se a leitura for células por mililitro (células/mL), multiplique o valor registrado por 1,5 para obter o número total de células por poço.NOTA: Outros métodos de contagem de células, como um hemocitômetro, serão suficientes se o laboratório não tiver um contador Coulter. 2. Traçadode isótopos estáveis 13 C 4-Aspartato e análise LC-MS para medir a atividade de DHODH 13ºTraçado de isótopos estáveis de C 4-aspartato em células aderentesNOTA: A atividade do DHODH pode ser monitorada diretamente medindo a incorporação de 13 C 4-aspartato em 13C3-UMP. Brequinar é usado como controle da atividade do DHODH (Figura 3). Os níveis resultantes de 13C3-UMP são uma medida da atividade de DHODH.Seme entre 250.000 e 500.000 células em um prato de 6 poços para atingir 75% de confluência no dia seguinte. Preparar uma solução-mãe de 250 mM 13 C 4-aspartato e 10 mM 13C4-aspartato (ver quadro 1). Troque o meio em cada poço para meio contendo 10 mM 13C 4-aspartato. Incubar durante o número adequado de horas para atingir um estado estacionário para a marcação das células de interesse.Observação : O estado estacionário é definido como o período de tempo no qual a porcentagem rotulada metabólito platôs ao longo do tempo14. Para células de osteossarcoma 143B, 13C 4-aspartato atinge um estado estacionário em 8 h. É uma boa prática determinar esse período de tempo antes da experimentação fazendo um experimento de curso de tempo com o isótopo estável de interesse. Isolamento de metabólitos das células aderentesAntes de começar, prepare um balde de gelo seco e prepare 80% de MeOH de grau HPLC em água de grau HPLC. Resfriar esse tampão em um freezer de -80 °C durante a noite ou colocá-lo diretamente no gelo seco. Retirando uma placa de cada vez da incubadora, aspirar o meio dos poços e lavar 2x com 1x PBS. Remova todo o PBS residual dos poços antes de passar para a próxima etapa.NOTA: Certifique-se de inclinar a placa durante a aspiração e pipetar contra a parede da placa para evitar o rompimento das células aderentes. Coloque a placa sobre gelo seco e adicione imediatamente 800 μL de MeOH de grau LCMS a 80% em água de grau LCMS a 20% em cada poço. Incubar a placa durante pelo menos 15 minutos num congelador de -80 °C para facilitar a lise celular.NOTA: Neste ponto, a próxima placa pode ser retirada da incubadora e as etapas 2.2.1-2.2.4 repetidas. Continue assim até que todas as placas estejam incubadas no congelador de -80 °C. Retirando uma placa de cada vez do congelador, raspe cada poço em gelo seco usando um elevador de células e transfira o lisado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Mantenha o tubo em gelo seco até o próximo passo. Vórtice todos os tubos durante 10 min a 4 °C e, em seguida, centrifugar a 4 °C durante 10 min à velocidade máxima (pelo menos 17.000 × g). Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e seque em um concentrador de vácuo de 4 °C equipado com uma armadilha fria de -105 °C em uma configuração de alto vácuo por aproximadamente 6 h ou até que as amostras tenham evaporado. Depois de seco o lisado, armazene os pellets de metabolitos a -80 °C até estarem prontos para os preparar para cromatografia líquida emparelhada com espectrometria de massas (LCMS). Medição por cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS) de metabólitos polaresNOTA: Qualquer fluxo de trabalho cromatográfico e espectrometria de massa que permita a detecção de aspartato, intermediários na biossíntese de pirimidina de novo e UMP será suficiente14.Preparar as amostras para LCMS no gelo adicionando 100 μL de água de grau HPLC aos pellets secos e vórtice por 10 min a 4 °C. Centrifugar as amostras a 4 °C durante 10 min à velocidade máxima (pelo menos 17 000 × g) e mover 25 μL para cada frasco para injetáveis LC-MS. Injetar 2 μL de lisado no sistema LC-MS. Uma metodologia comumente usada é dada abaixo:Preparar a fase móvel A composta por carbonato de amônio 20 mM (grau LC-MS) e hidróxido de amônio 0,1% (grau LC-MS) dissolvido em água grau LC-MS. Escolha 100% acetonitrila (LC-MS Grade) como fase B móvel. Para a cromatografia, escolha uma coluna analítica de 5 μm, 150 mm x 2,1 mm equipada com uma coluna de proteção de 2,1 mm x 20 mm para compostos hidrofílicos (consulte a Tabela de Materiais). Leve o forno de coluna a 25 °C. Use as seguintes configurações de cromatografia líquida: fluxo constante de 0,15 mL/min; um gradiente linear de 80% a 20% da Fase Móvel B por 20 min, seguido por um gradiente linear de 20% a 80% da Fase Móvel B por 0,5 min, seguido por uma espera a 80% da Fase B Móvel por 7,5 min. Escolha as seguintes configurações do espectrômetro de massa: uma varredura completa entre m/z 70 Da e 1.000 Da; uma resolução de 70.000; uma meta AGC de 1 × 106; e tempo máximo de injeção de 20 ms. Opere a fonte no modo de comutação de polaridade. Ajuste a tensão de pulverização em 3,0 kV, o capilar aquecido em 275 °C, a sonda HESI em 350 °C, o fluxo de gás da bainha em 40 unidades, o fluxo de gás auxiliar em 15 unidades e o fluxo de gás de varredura em 1 unidade. Execute a análise de dados usando qualquer software que faça interface com o fluxo de trabalho do LCMS.NOTA: Os softwares usados com o fluxo de trabalho acima são XCalibur (Thermo) e TraceFinder (Thermo). As principais considerações para a análise de dados são descritas a seguir:Tempos de retenção esperados: Determinar o tempo de retenção de cada metabolito executando os padrões para cada metabolito de interesse utilizando o método cromatográfico antes da experiência.NOTA: Os tempos de retenção de UMP e seus isotopólogos, incluindo 13C3-UMP, são exatamente os mesmos. M/Z esperado para metabolitos: Se um metabolito ionizar no modo de iões negativos (como UMP), calcule a massa exata esperada utilizando a fórmula molecular de UMP menos um próton [C 9 H14N2O9P]. Para metabólitos que ionizam no modo de íon positivo, calcule a massa exata usando a fórmula molecular mais um próton. Precisão de massa: Ao usar um espectrômetro de massa orbitrap, espera-se que o metabólito de interesse e seus isotopólogos tenham uma precisão de massa ±5 mmu. Use um software para calcular isso, contabilizando o M/Z esperado e o M/Z real detectado. Correção da abundância natural: Espera-se que todos os dados de rastreamento passem por correção de abundância natural para explicar os ~1% 13C e ~0,5% 15 N-isótopos na natureza 15. 3. 13C 5-glutamina estável isotopo traçado para medir a atividade SDH 13ºTraçado de isótopos estáveis de C 5-glutamina em células aderentesNOTA: A atividade do SDH pode ser monitorada diretamente pela medida da interconversão de certos isotopólogos de fumarato e succinato no traçado de 5-glutamina a 13C 7,16,17. O inibidor do complexo III antimicina é usado como controle para alterar a direcionalidade líquida do complexo SDH (Figura 4).Seme entre 250.000 e 500.000 células em um prato de 6 poços para atingir 75% de confluência no dia seguinte. Preparar uma amostra de 50 mM 13C 5-glutamina (ver Tabela 1). Preparar meio de rastreio contendo 2 mM 13C 5-glutamina (ver Tabela 1). Trocar o meio de cada poço para meio contendo 2 mM 13C 5-glutamina. Incubar durante o número adequado de horas para atingir um estado estável de marcação das células de interesse (ver a nota no passo 2.1.3). Isole os metabolitos seguindo o protocolo do passo 2.2. Analise as amostras no LC-MS seguindo o fluxo de trabalho descrito na etapa 2.3. Analisando a atividade dos DSS com base em padrões de rotulagemNOTA: A atividade de oxidação do succinato do complexo SDH pode ser monitorada avaliando-se a proporção de 13 C 4-fumarato para 13 C4-succinato sobre 13C5-glutamina traçado. A atividade de redução do fumarato do complexo SDH pode ser monitorada avaliando-se a proporção de 13 C 3-succinato para 13C3-fumarato sobre o traçado de 13C5-glutamina.Calcular a porcentagem de rotulagem de 13 C 3-fumarato, 13 C 4-fumarato, 13 C3-succinato e 13 C4-succinato. Por exemplo, para determinar a porcentagem de 13 C 3-fumarato, somar todas as áreas de pico integradas para os isotopólogos de fumarato (fumarato não marcado, 13 C1-fumarato, 13C 2-fumarato, 13 C3-fumarato e 13 C4-fumarato) e dividir a área do pico para 13C 3-fumarato pela área total do isotopólogo. Multiplique por 100. Para calcular a oxidação do succinato, divida a porcentagem 13 C 4-fumarato pela porcentagem 13C 4-succinato. Para calcular a redução do fumarato, divida a porcentagem 13 C 3-succinato pela porcentagem 13C 3-fumarato. 4. Ensaio direto de atividade complexa I NOTA: DCPIP é um aceitador artificial de elétrons; Ele muda para sua forma reduzida ao aceitar elétrons de ubiquinol. Neste ensaio, a ubiquinona é reduzida a ubiquinol através da oxidação complexa I-mediada de NADH a NAD+. Assim, medir o turnover de DCPIP oxidado neste ensaio livre de células é um proxy para a atividade do complexo I 7,18. Purificação e quantificação das mitocôndrias das célulasNOTA: Qualquer protocolo de purificação mitocondrial pode ser utilizado para este ensaio19.Expandir as células até que 25-100 milhões de células sejam obtidas. Aspirar o meio fora da louça, lavar com 1x PBS, aspirar o PBS e tentar espiar as células com tripsina a 0,25%. Temperar a tripsina com meio de cultura e pellet as células a 1.000 × g por 5 min. Lave os pellets de células 2x em 5 mL de PBS 1x e repita a centrifugação a 1.000 × g por 5 min para peletizar as células. Conservar os pellets lavados num congelador de -20 °C até à purificação mitocondrial.NOTA: Não congele-descongele os pellets de células mais do que uma vez. Preparar tampão de isolamento mitocondrial (ver Tabela 1).NOTA: Reagentes contendo sódio, como NaOH, não devem ser usados para preparar tampões de isolamento mitocondrial, pois o sódio mancha o potencial de membrana mitocondrial20 e interrompe a homeostase mitocondrial do cálcio21. Ressuspender os pellets celulares para 10 milhões de células por 1 mL de tampão de isolamento mitocondrial. Por exemplo, ressuspender 100 milhões de células peletizadas em 10 mL de tampão de isolamento mitocondrial.NOTA: Certifique-se de interromper os aglomerados celulares sem introduzir bolhas no buffer. Mover 2 mL de suspensão celular para um homogeneizador de vidro pré-resfriado com um volume de trabalho de 3-8 mL compatível com um pilão de PTFE Potter-Elvehjem. Homogeneizar as células com 10-20 cursos, monitorando as células ao microscópio para confirmar a lise celular durante todo o processo de homogeneização. Aumente o número de acidentes vasculares cerebrais, se necessário, para garantir a lise celular eficiente.NOTA: Se a homogeneização das células com o método acima não for eficaz para lisar as células, mude para um método de lise de seringa22. Transfira 2 mL do lisado celular para um tubo de microcentrífuga sobre gelo e repita as etapas acima até que toda a suspensão celular seja homogeneizada. Pellet os núcleos e restos celulares a 650 × g por 10 min em centrífuga a 4 °C. Mover o sobrenadante para um novo tubo de 2,0 ml e repetir a centrifugação acima a 650 × g durante 10 minutos a 4 °C. Mover o sobrenadante para um novo tubo de 2,0 ml e peletar a mitocôndria bruta a 7.000 × g durante 10 minutos numa centrífuga a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão de isolamento mitocondrial. Mover 50 μL para um novo tubo para quantificação de proteínas. Repita o passo de centrifugação acima nas duas alíquotas da amostra (a amostra de 50 μL e os ~950 μL restantes). Descarte o sobrenadante e guarde os pellets em um freezer de -80 °C até que estejam prontos para uso. Adicionar 200 μL de tampão RIPA aos pellets da alíquota de 50 μL para extrair a proteína, vórtice por 10 min e centrifugar a 21.000 × g para isolar a proteína. Quantificar a quantidade de proteína na alíquota de 50 μL e usar esse número para quantificar a proteína restante na amostra de 950 μL. Por exemplo, se a quantificação da proteína para a alíquota de 50 μL for de 1 μg/μL, a proteína total na pastilha mitocondrial restante é de 950 μg (1 μg/μL × 950 μL). Realizando o ensaio de atividade complexa INOTA: A linhagem celular de osteossarcoma 143B foi utilizada para este ensaio, mas o protocolo pode ser adaptado para qualquer cultura de células.Ressuspender as mitocôndrias purificadas no tampão de ressuspensão mitocondrial (ver Tabela 1) até uma concentração final de 5 mg de proteína/ml. Realizar cinco ciclos de congelamento/descongelamento em um freezer de -20 °C para permeabilizar as mitocôndrias. Faça o buffer de ensaio de atividade I complexo (consulte a Tabela 1). Misturar 50 ug do estoque mitocondrial de 5 mg/mL com 90 μL de tampão de atividade do complexo I. Preparar cinco réplicas não tratadas e cinco repetições tratadas com rotenona (5 μM) para controlar a atividade do complexo I. Leia a absorbância basal a 600 nm em um leitor de placas ajustado para 37 °C. Iniciar a reação adicionando NADH a uma concentração final de 2 mM e rastrear a absorbância (600 nm) durante o período de 1 h, medindo pelo menos a cada 2 min durante todo o processo. A diminuição da absorbância é indicativa de uma redução do DCPIP via atividade do complexo I.NOTA: O NADH deve ser adicionado usando uma pipeta multicanal para garantir que todas as amostras sejam iniciadas ao mesmo tempo. 5. Ensaio baseado em LC-MS para medir os níveis de superóxido NOTA: As propriedades de fluorescência do MitoSox Red podem mudar independentemente de sua reação com superóxido23. Este ensaio baseado em LC-MS mede diretamente o produto do superóxido reagindo com MitoSox Red. O ensaio a seguir é ligeiramente modificado de Xiao et al.24. O 2-hidroximitoetídio (2-OH MitoE2+) é o produto da reação de superóxido (Figura 5). A linhagem celular Caki1 foi utilizada para este ensaio, mas o protocolo pode ser adaptado para qualquer cultura de células. Tratamento de células aderentes com MitoSox RedSeme entre 250.000 e 500.000 células em um prato de 6 poços para atingir 75% de confluência no dia seguinte. Certifique-se de semear um conjunto de placas para o ensaio LC-MS e um conjunto duplicado de placas para normalização da contagem de células. Preparar DMEM completo contendo 10% de FBS inativado pelo calor e 1% de penicilina-estreptomicina no meio Eagle modificado de Dulbecco. Refrescar o meio em todos os poços para todas as condições com 2 mL de DMEM completo. Certifique-se de adicionar quaisquer medicamentos ou tratamentos de interesse neste momento. Incubar as células em estufa de cultura de tecidos por 1 h. Preparar controles positivos e negativos. Preparar uma reserva de 50 mM de hidroperóxido de terc-butilo diluída em PBS e uma reserva de 250 mM de N-acetilcisteína (NAC) diluída em DMSO (ver Tabela 1).NOTA: O hidroperóxido de tertbutila (tBuOOH) é uma potente espécie reativa de oxigênio que atuará como um controle positivo e aumentará a quantidade de 2-OH MitoE2+. NAC é um potente antioxidante que atuará como um controle negativo e neutralizará a produção de superóxido causada pelo tBuOOH. Adicionar 1 μL de tBuOOH aos poços de controle positivo e 1 μL de tBuOOH + 100 μL de NAC aos poços de controle negativo.NOTA: O uso de uma pipeta P2 (faixa de 0,1-2 μL) é a maneira ideal de transferir 1 μL. Incubar por 1 h em incubadora de cultura de tecidos. Preparar 1 mM de MitoSox Red (ver Tabela 1) e adicionar 2 μL de 1 mM de MitoSox Red a cada poço para atingir uma concentração final de 1 μM. Incubar por 30 min em uma incubadora de cultura de tecidos. Durante essa incubação final, conte uma das placas duplicadas para adquirir a contagem de células para normalizar os dados finais de LC-MS. Isolamento do produto Mitosox Red oxidado das células aderentesObtenha um balde de gelo seco e coloque isopropanol fresco de grau HPLC no gelo seco antes de iniciar o isolamento. Retirando uma placa de cada vez, aspirar o meio dos poços e lavar 2x com 1 mL de 1x PBS. Aspirar todo o PBS residual dos poços antes de passar para a próxima etapa.NOTA: Certifique-se de inclinar a placa durante a aspiração e pipetar contra a parede da placa para evitar a ruptura das células aderentes. Coloque a placa sobre gelo seco e adicione 800 μL de isopropanol grau HPLC a cada poço. Incubar a placa durante pelo menos 15 minutos num congelador de -80 °C para facilitar a lise celular.NOTA: Neste ponto, a próxima placa pode ser retirada da incubadora e as etapas 5.2.1-5.2.4 repetidas. Continue assim até que todas as placas estejam incubadas no congelador de -80 °C. Retirando uma placa de cada vez do congelador, raspe cada poço em gelo seco usando um elevador de células e transfira o lisado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Mantenha o tubo em gelo seco até o próximo passo. Vórtice todos os tubos durante 10 min a 4 °C e, em seguida, centrifugar a 4 °C durante 10 min à velocidade máxima (pelo menos 17.000 × g). Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e seque em um concentrador de vácuo. Depois de secar o lisado, armazene os pellets de metabolitos a -80 °C até estar pronto para LC-MS. Dosagem de MitoSox Red e 2-hidroxi-mitoetídio (2-OH MitoE2+) em LC-MSPreparar as amostras para LCMS no gelo adicionando 100 μL de uma mistura 3:3:1 de MeOH:clorofórmio:água de grau HPLC. Vórtice por 10 min a 4 °C. Mover 25 μL para cada frasco para injetáveis LC-MS. Conservar a amostra restante no congelador a -80 °C. Preparar os seguintes tampões de cromatografia líquida: i) tampão A: água de grau HPLC com 0,1% de ácido fórmico; ii) tampão B: acetonitrila grau HPLC com ácido fórmico a 0,1%. Abra o aplicativo Thermo XCalibur Instrument Setup para começar a desenvolver o método. Procure duas caixas na barra lateral esquerda desta janela – a primeira caixa permite o desenvolvimento do método de cromatografia, e a segunda caixa permite o desenvolvimento do método de espectrometria de massa. Desenvolvimento do método de cromatografia líquida:Ajuste um fluxo de 0,25 mL/min e inicie o método em 20% B, subindo para 95% B no período de 12 min. No minuto seguinte, baixe o buffer B de volta para 20% B e mantenha esse nível pelos próximos 2 min.NOTA: Os últimos 2 min de fluxo a 20% B são críticos para que a pressão da coluna volte à pressão inicial e equilibre a coluna com as razões de tampão apropriadas. A não inclusão dessa etapa de equilíbrio fará com que os tempos de retenção mudem para todas as amostras executadas subsequentemente. Crie um arquivo de ajuste com os seguintes parâmetros:Abra o aplicativo Tune e crie um novo arquivo de ajuste. Aplique quaisquer configurações sobrepostas do módulo Configuração do método (consulte a etapa 5.3.9.3) a esse arquivo de ajuste também, incluindo o intervalo de verificação, resolução, polaridade, destino AGC e TI máximo. Defina o gás de bainha para 30, o gás Aux para 3 e o gás de varredura para 3 também. Ajuste a tensão de pulverização para 3 kV, a temperatura capilar para 300 e o nível de RF da lente S para 60. Desenvolvimento do método de espectrometria de massas:Na lista inferior esquerda de possíveis varreduras, arraste e solte Full MS para o centro da janela. Certifique-se de clicar no quadrado MS completo após a queda para ajustar as configurações. A duração total do método MS é de 13 min.NOTA: O método LC é mais longo do que o método MS porque os 2 min finais são para recondicionamento da coluna e não quantificação de metabolitos. No lado direito do módulo, em Propriedades do método, verifique se a duração do método e o tempo de execução estão definidos como 13,00 min. Execute esta verificação completa no modo positivo em uma resolução de 70.000 e uma meta AGC de 1 × 106. Defina o IT máximo para 100 ms e o intervalo de varredura de 300 m/z a 700 m/z. Em Ajustar arquivos na parte superior do módulo, observe que o arquivo de ajuste que acabou de ser criado está vinculado a esse método. Execute o método para detecção de MitoSox Red com injeções de amostra de 2 μL.

Representative Results

As atividades do DHODH, do complexo I e do complexo V podem ser avaliadas por meio de ensaios de proliferação. Após a privação da uridina do meio de cultura, as células tornam-se mais dependentes da via de novo para a biossíntese de pirimidina. Assim, quando as células foram desafiadas a proliferar em um meio livre de uridina, elas foram mais sensíveis à inibição da atividade do DHODH pelo brequinar do que as células cultivadas em um meio contendo uridina (Figura 6A). Da mesma forma, a privação do piruvato do meio de cultura torna as células mais dependentes da atividade do complexo I para proliferação. Assim, quando as células foram desafiadas a proliferar em meio livre de piruvato, elas foram mais sensíveis à inibição da atividade do complexo I pela rotenona do que as células cultivadas em meio contendo piruvato (Figura 6B). A atividade do complexo V pode ser avaliada desafiando as células a proliferarem em um meio contendo galactose em vez de glicose. Como a galactose produz ATP líquido zero na glicólise, as células que crescem neste combustível são mais dependentes da síntese de ATP mitocondrial via atividade do complexo V. Assim, as células que proliferavam em meio contendo galactose eram mais sensíveis à inibição do complexo V pela oligomicina do que as células que proliferavam em meio contendo glicose (Figura 6C). A atividade do SDH pode ser medida usando o traçado de 5-glutamina 13C e monitorando sua incorporação em isotopólogos de fumarato e succinato. Em condições tratadas com veículo, o complexo SDH favoreceu a atividade anterior, e a incorporação de 13 C 4-succinato em 13 C4-fumarato foi maior do que a incorporação de 13 C 3-fumarato em 13C 3-succinato (Figura 7). Nas condições tratadas com antimicina, o complexo SDH favoreceu a atividade reversa, e a incorporação de 13 C 3-fumarato em 13 C3-succinato foi maior do que a incorporação de 13 C 4-succinato em 13C 4-fumarato (Figura 7). A produção de superóxido dentro da mitocôndria pode ser medida usando o repórter fluorescente MitoSox, que gera 2-hidroxi-mitoetídio após a reação com superóxido. Neste estudo, as células tratadas com MitoSox na presença de peróxido de hidrogênio tertbutílico apresentaram níveis mais elevados de 2-hidroximitoetídio de forma suprimida pela adição de NAC, um antioxidante que extingue as ROS celulares (Figura 8). Figura 1: Base mecanística para o ensaio de proliferação do complexo V. Oxidação de glicose e galactose via glicólise. A glicose produz dois ATP líquidos da glicólise, enquanto a galactose produz ATP líquido zero porque a síntese de UTP é necessária para a UDP-galactose. Assim, as células cultivadas em galactose são mais dependentes da síntese de ATP mitocondrial devido à falta de ATP produzido a partir da glicólise. Abreviações: GALK = galactocinase; GALT = galactose-1-fosfato uridililtransferase; PGM1 = fosfoglucomutase 1; GPI = glicose-6-fosfato isomerase, UGP = UDP-glicose pirofosforilase; GALE = UDP-galactose-4-epimerase; NDK = nucleotídeo difosfato quinase; UMPK = uridina monofosfato quinase; HK = hexoquinase; PFK = fosfofrutoquinase; ALDO = aldolase; TPI = triosefosfato isomerase; GAPDH = gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; PGK = fosfoglicerato quinase; PGM = fosfoglucomutase; ENO = enolase; PK = piruvato quinase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Base mecanicista para o ensaio de proliferação complexa I. Esquema das vias metabólicas que são alteradas com a inibição da atividade do complexo I. Em meios com alto piruvato, a inibição do complexo I é contornada pela oxidação de NADH mediada por LDH. Em meios com baixo teor de piruvato, essa adaptação é menos viável, tornando as células mais dependentes da atividade do complexo I para reoxidar o NADH. Abreviações: LDH = lactato desidrogenase; Ciclo do TCA = ciclo do ácido tricarboxílico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Esquema da reação DHODH no traçado de 13C 4-aspartato. Brequinar inibe a oxidação diidroorotato para orotato, impedindo assim a síntese a jusante de UMP. 13ºC 4-aspartato é incorporado em 13C3-UMP via atividade DHODH. Abreviações: OMM = membrana mitocondrial externa; IMM = membrana mitocondrial interna; DHODH = diidroorotato desidrogenase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Medição da atividade do complexo II anterior e reverso através do traçado de 5-glutamina a 13C. Para medir a atividade direta do complexo II (esquerda), a incorporação de 13 C 5-glutamina em 13 C 4-succinato e 13C 4-fumarato é monitorada. Para medir a atividade do complexo II reverso (à direita), a incorporação de 13 C 5-glutamina em 13 C 3-succinato e 13C 3-fumarato é monitorada. Abreviações: SDH = succinato desidrogenase; CytC = citocromo C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Reação de MitoSox Red com superóxido. A reação de MitoSox com superóxidos mitocondriais para formar 2-OH-MitoE2+. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Ensaios baseados em proliferação para medir a função mitocondrial (A) Proliferação de células de osteossarcoma 143B tratadas com brequinar 5 uM, um inibidor de DHODH, em meio com uridina ±100 ug/mL. Os dados são médios ± MEV; N = 3 por condição. (B) Proliferação de células do osteossarcoma 143B tratadas com a rotenona 2 uM, um inibidor do complexo I, em meio com piruvato ±5 mM. Os dados são médios ± MEV; N = 3 por condição. (C) Proliferação de células de osteossarcoma 143B tratadas com oligomicina 5 uM, um inibidor do complexo V, em meio com glicose 10 mM ou galactose 10 mM como única fonte central de carbono. Os dados são médios ± MEV; N = 3 por condição. * indica p < 0,05 usando um teste ANOVA unidirecional no Graphpad Prism. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: Traçado 13C 5-glutamina para medir a atividade do complexo II. Oxidação de succinato e redução de fumarato (SDH reverso) em células Caki1 e DLD1 tratadas com DMSO e antimicina A 500 nM. Os dados representam média ± EPM; N = 3 por condição. indica p < 0,05 usando um teste t não pareado no GraphPad Prism. Abreviações: SDH = oxidação do succinato; SDH reverso = redução do fumarato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8: Ensaio MitoSox baseado em LCMS para detectar superóxido. Cromatograma iônico extraído de 2-OH-Mito E2+ isolado de células Caki1 tratadas com MitoSox por 30 min na presença de tBuOOH ± NAC. Abreviaturas: LCMS = cromatografia líquida-espectrometria de massas; NAC = N-acetilcisteína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Tabela 1: Composição dos reagentes, buffers e meios utilizados neste protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussion

Como pesquisas emergentes demonstram que as mitocôndrias de mamíferos podem funcionar sem consumir oxigênio molecular, é de extrema importância que os pesquisadores empreguem ensaios ortogonais, além das medições de OCR, para quantificar com precisão a função mitocondrial. Aqui, compilamos uma série de ensaios que podem ser usados para avaliar diretamente as atividades do complexo I, complexo II, complexo V e DHODH medindo o balanço NAD+/NADH mitocondrial, a utilização de aceptores de elétrons terminais adaptativos, a produção de ATP, biossíntese de pirimidina de novo e ROS derivadas de mitocôndrias. Notavelmente, esses ensaios medem mais diretamente a função mitocondrial do que as medidas de OCR. Além disso, esses ensaios fornecem aos pesquisadores maneiras tratáveis de quantificar a função mitocondrial durante a hipóxia, para a qual as medidas de OCR são em grande parte irrelevantes devido ao fumarato ser usado como o aceitador de elétrons terminal favorecido. Finalmente, os métodos baseados em proliferação descritos aqui são mais custo-efetivos do que os experimentos clássicos de respirometria, fornecendo uma maneira amplamente acessível de estudar a função mitocondrial em sistemas de mamíferos.

Existem considerações importantes ao utilizar esses ensaios para medir a função mitocondrial em células cultivadas. Em relação aos ensaios de proliferação, é importante ajustar o número de células semeadas para a taxa de duplicação de cada linhagem celular. As células devem ser semeadas com pelo menos 10% de confluência e com espaço suficiente para permitir três a quatro duplicações para que as diferenças na proliferação possam ser quantificadas. Outra consideração para cada ensaio é a concentração das pequenas moléculas usadas como controles para as atividades de cada complexo ETC. Como diferentes linhagens celulares podem apresentar diferentes sensibilidades a esses inibidores, é fundamental testar a dose dessas pequenas moléculas para identificar a concentração ideal.

Uma limitação universal dos ensaios que estudam a função mitocondrial in vitro, incluindo medidas de OCR e todos os ensaios aqui descritos, é a composição metabólica do meio de cultura. O meio de cultura celular padrão tende a enviesar os sistemas para níveis superficialmente altos de função mitocondrial. Por exemplo, níveis suprafisiológicos de glutamina aumentam sua anaplerose do ciclo do TCA25, o que alimenta a síntese mitocondrial de NADH e, consequentemente, aumenta a fosforilação oxidativa. Da mesma forma, a pressão parcial de oxigênio varia entre 3 mmHg e 100 mmHg (aproximadamente 0,1%-13%O2) em tecidos de mamíferos, mas é atmosférica (140 mmHg, aproximadamente 21%) in vitro26,27. Esse excesso de O2 maximiza a capacidade respiratória mitocondrial e a produção de superóxido28. Recentemente, esforços têm sido feitos para projetar meios de cultura mais fisiológicos29,30. Notavelmente, a cultura de células em meios semelhantes a plasma humano diminui a respiração mitocondrial em algumas linhagens de células cancerosas30, as ROS mitocondriais em células T31 e as adaptações mitocondriais à terapêutica do câncer32. Assim, é fundamental estar atento à composição dos meios de cultura que estão sendo utilizados e entender como isso pode impactar a função mitocondrial.

Outra limitação importante e universal na interpretação da função mitocondrial é o potencial para diferenças no número de mitocôndrias. É, portanto, fundamental medir o conteúdo mitocondrial através da quantificação do mtDNA33, da medida da massa mitocondrial com corantes insensíveis ao potencial de membrana34 ou do western blotting de marcadores mitocondriais. Este é um controle crítico para que uma diminuição no número de mitocôndrias não seja confundida com uma diminuição na função mitocondrial.

Há também limitações específicas e solução de problemas que se aplicam aos ensaios descritos aqui. Primeiro, dado que células diferenciadas não proliferam, os ensaios baseados em proliferação não serão úteis para avaliar a função mitocondrial neste contexto. Uma limitação fundamental do protocolo de rastreamento de 13C 4-aspartato para medir a atividade de DHODH é que a captação de aspartato nas células pode ser extremamente ineficiente35. Para superar essa limitação potencial, os pesquisadores podem superexpressar o transportador de aspartato, SLC1A3, para facilitar a captação de 13C 4-aspartato35.

Uma limitação do protocolo que utiliza o traçado 13C 5-glutamina para medir a atividade de SDH é que este ensaio requer que as células utilizem a via de carboxilação redutiva para enriquecer os isotopólogos M+3 a fim de medir a atividade reversa. Algumas linhagens celulares são incapazes de fluxo redutivo de carboxilação devido à baixa expressão de ATP citrato liase36, estabilização insuficiente de HIF37 ou uma relação α KG:citrato muito baixa38. Para superar essa limitação, pode-se utilizar o traçado 13C 4-aspartato para medir as atividades direta e reversa do SDH7. Neste ensaio, a atividade direta do SDH pode ser medida pela razão fumarato M+2:succinato M+2 e a reação reversa pelo succinato M+4:fumarato M+4. Notavelmente, este traçado contorna a maioria das enzimas na via de carboxilação redutiva.

Uma limitação do ensaio de atividade do complexo I usando redução DCPIP como leitura é que as mitocôndrias não estão estruturalmente intactas. O processo de congelamento-descongelamento das mitocôndrias para permitir sua captação de NADH para o ensaio certamente pode manchar a integridade estrutural da membrana mitocondrial39. Este ensaio deve ser realizado em paralelo com ensaios como o ensaio de proliferação do complexo I para garantir que as mudanças na atividade do complexo I observadas também sejam verdadeiras com células intactas.

Em estudos futuros, algumas dessas técnicas podem ser adaptadas para medir funções mitocondriais in vivo usando organismos modelo como camundongos e Caenorhabditis elegans. Os métodos atuais usados para medir a função mitocondrial in vivo estão centrados no OCR em nível de organismo, especificamente na taxa de troca respiratória quando se usa modelos de camundongos. Uma limitação clara deste método é que o oxigênio serve muitas funções bioquímicas e de sinalização além de seu papel como um aceptor de elétrons terminais ubíquo na ETC mitocondrial. Por exemplo, o oxigênio é “consumido” pela atividade catalítica de enzimas da família das dioxigenases. Embora essas enzimas contribuam para a taxa de consumo celular de oxigênio, elas não participam, regulam ou refletem a função mitocondrial. Experimentos clássicos de respirometria in vitro tipicamente controlam o “OCR não mitocondrial”, enquanto os experimentos de razão de troca respiratória do organismo (RER) não podem controlar isso, limitando a interpretação do RER como uma métrica para a função mitocondrial in vivo. No entanto, é viável adaptar os protocolos para medir a atividade de DHODH via traçado de 4-aspartato de 13 C, atividade do complexo II via traçado de5-glutamina de 13C, atividade do complexo I em mitocôndrias purificadas detecidos e ROS mitocondrial usando compostos amigáveis ao LC-MS como MitoB para medir a função mitocondrial in vivo. Esses ensaios diretos para interrogar funções mitocondriais, em combinação com experimentos clássicos de respirometria, fornecem aos pesquisadores uma avaliação mais abrangente e precisa da função mitocondrial em células e tecidos de mamíferos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

As figuras produzidas neste manuscrito foram criadas com BioRender.com. Somos gratos a Amy Walker por fornecer feedback sobre este artigo. J.B.S. foi apoiado pela Worcester Foundation for Biomedical Research Grant.

Materials

 1.5 mL tube Cell Treat 667443
2.0 mL tube Cell Treat 229446
6-well plate Cell Treat 229106
12-well plate Cell Treat 229112
13C4-aspartate Sigma-Aldrich 604852
13C5-Glutamine Cambridge Isotope Laboratories 285978-14-5
15 mL centrifuge tube Cell Treat 667411
50 mL centrifuge tube Cell Treat 667421
150 mm tissue culture dish Cell Treat 229651
1x Phosphate-buffered saline Gibco 10010049
2,6-dichlorophenolindophenol Honeywell 33125
Ammonium Carbonate Sigma-Aldrich 37999
Antimycin Sigma-Aldrich A8674
Ascentis Express C18 Sigma-Aldrich 53825-U
Bottle top filter 500 mL, 0.22 µm, PES 9 9 mm membrane diameter Cell Treat 229717
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3294
Brequinar Sigma-Aldrich SML0113
Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade Cell Treat 229305
CentriVap -105 Cold Trap Labconco 7385020
Complete Protease Inhibitor Tablets Sigma-Aldrich  4693116001
Coulter Counter Cups Fisher Scientific 07-000-694
Decylubiquinone Sigma-Aldrich D7911
DMSO Invitrogen D12345
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11995-065
EDTA Sigma-Aldrich E6758
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Eppendorf Centrifuge 5425R Eppendorf 2231000908
Eppendorf Centrifuge 5910 Ri Eppendorf 5943000343
Galactose Sigma-Aldrich G5388
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glucose-free DMEM Gibco 11966025
Glutamine-free DMEM Thermo Fisher 11960044
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135
Hepes Sigma-Aldrich H3375
HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide Thermo Scientific 460801000
HPLC-grade Acetonitrile Sigma-Aldrich 900667
HPLC-grade Chloroform Sigma-Aldrich 366927
HPLC-grade formic acid Thermo Scientific 28905
HPLC-grade Isopropanol Sigma-Aldrich 563935
HPLC-grade MeOH Sigma-Aldrich 900688
HPLC-grade Water Sigma-Aldrich 270733
Human Osteosarcome Cell Line 143B ATCC CRL-8303
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331-500ML
Isotone buffer Beckman Coulter 8546719
K2HPO4 Sigma-Aldrich P2222
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
MitoSox Red Invitrogen M36008
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351-5MG
Pencillin Streptomycin Gibco 15140-122
Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21 Kimble 885502-0021
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Pyruvate-free DMEM media Gibco 11965175
Q Exactive Plus Mass Spectrometer Thermo Scientific 726030
ReCO2ver Incubator Baker
Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator Labconco 7310020
RIPA Buffer Millipore Sigma 20188
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2.1 mm analytical column Sigma-Aldrich 1.50460.0001
SeQuant ZIC-pHILIC guard kit Millipore Sigma 1.50438.0001
Sodium Hydroxide, Pellets Millipore Sigma 567530-250GM
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SW, TRACEFINDER 5.1 SP3 Thermo Scientific OPTON-31001
Tert-butyl hydroperoxide solution Sigma-Aldrich 458139
Tris Sigma-Aldrich 93352
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25-200-114
Uridine Sigma-Aldrich U3003
VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC Thermo Scientific VF-S01-A-02
Z2 Coulter Particle count and size analyzer Beckman Coulter BZ10131270
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Tseyang, T., Valeros, J., Vo, P., Spinelli, J. B. Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals. J. Vis. Exp. (195), e65184, doi:10.3791/65184 (2023).
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